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原代细胞培养和传代培养的方法
发布时间： 2021-07-07 点击次数： 1289次原代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至 37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640 培养基（含 20%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒初代消化培养法1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒 20 分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用 Hanks 液漂洗 2~3 次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中 30~60 分钟。4. 剪切：用眼科剪把组织切成 2~3 毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50 倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。5. 消化：或用恒温水浴，或置于 37℃温箱消化均可，消化中每隔 20 分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500~1000 转/分）离心消化液 5 分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH 要求在 7.2~7.4 范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3 调整。8. 培养：置于 36.5℃温箱培养，如用 CO2 温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。初代组织块培养法1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用 Hanks 液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静 Hanks 液，用眼科剪反复剪切 1mm3 块为止。2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以 0.5cm 为宜，每一 25ml 培养瓶底可摆布 20~30 块。3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置 36.5℃温箱培养 2 小时左右（勿超过 4 小时），使小块微干涸。4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46 度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。材料和试剂1. 细胞：贴壁细胞株2. 试剂：0.25％胰酶、1640 培养基（含 10％小牛血清或胎牛血清）3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤1. 吸除培养瓶内旧培养液。2. 向瓶内加入胰蛋白酶和 EDTA 混合液少许，以能覆满瓶底为限。3. 置温箱中 2~5 分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。4. 吸除消化液，向瓶内注入 Hanks 液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加 Hanks 液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用 Hanks 液冲洗，直接加入培养液。5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。无菌操作注意事项1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用 75%酒精或 0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。5. 瓶子开口后要尽量保持 45℃斜位。6. 吸溶液的吸管等不能混用。深圳市安培生物科技有限公司推出各类进口胎牛血清和高效细胞转染试剂，均经过反复充分验证，培养细胞效果好且重复性佳。尊敬的客户您如在订购过程中遇到任何问题都可以与我司在线客服联系寻求帮助，新客户也可联系在线客服申请试用装。
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