【技术贴】DNA 纯化实验的几种常用方法

DNA 纯化是分子生物学研究中经常需要用到的一种方法。一般来说，做DNA 纯化有3 个目的：1. 获得高纯度的DNA；2. 浓缩DNA；3. 用DNA做测序，芯片等生物信息学方面的实验。下面，谈一谈DNA纯化的几种常用方法。

DNA 纯化实验基本上可以分为 PCR 清洁试剂盒纯化法和DNA凝胶回收纯化法两大类。PCR 清洁试剂盒纯化法又称为硅胶膜吸附法。因为它的原理是：硅胶膜可在高盐条件下结合 DNA， 又可在低盐条件下与DNA分离。而 DNA 溶液中的其他渣渣包括引物、单核苷酸、酶、矿物油、盐离子等，因为没有 DNA 的这种神特性，所以会被分离开来。  

如果你的 PCR 产物得到的是单一条带，*可以直接纯化。那么问题来了。如果发现有杂带？怎么办？有哪些办法可以提取得更干净？

那么就诞生了我们的第二种方法：DNA 凝胶回收纯化法。这种方法简单粗暴有效率，也能纯化得比较*。现在已经慢慢地取代了第一种方法，成为了DNA 纯化的主流方法。 扩增时出现非特异性条带，那么在胶回收时切胶很重要，切胶时尽量选择目的基因条带，可以将目的基因所在的胶的边缘弃去一些，尽量不要切上含有非特异性带的胶。切胶之后就是回收了，这里分享个小窍门，回收可以用酚氯仿。

PCR 产物经过酶切、回收等步骤后，损失太大。合适的做法是：简化步骤、减少核酸在处理过程中的损失，让较多量的 PCR 产物和质粒片断进入酶连反应——以量取胜。DNA 凝胶回收纯化法是很粗放型的，但是成功率很高。如果愿意，你可以试试。

大致的做法是：制作 100 μL PCR 产物；酒精沉淀回收 PCR 产物；PCR 产物及载体酶切；跑回收胶；将回收胶上的 PCR 产物和载体片断切下，回收到一个试管中；冰冻、碎胶，酚、氯仿 抽提，酒精沉淀；加入8微升水、1 微升连接酶和 1 微升连接 buffer，4 度过夜；转化涂板。

PCR 产物回收 

1. 制备 100μL PCR 产物。 

2. 将 100μL PCR 产物加入一 1.5mL 离心管中，再加入 400μL 双蒸水，颠倒混匀。加入 900μL  预冷无水乙醇、20μL3M 的醋酸钠。颠倒数次混匀。（提示 本方法使用的醋酸钠量较小，但足够沉淀核酸，并且无需洗盐。） 

3. 4℃静置 30 分钟，以利于核酸沉淀。 

4. 12000rpm 4℃ 离心 15 分钟，沉淀核酸。 

5. 弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸巾上 5 分钟。室温下吹风干燥。（提示 可将试管置于超净台吹风干燥。如果管底有较多液体聚集，可盖好管盖后，轻弹管底数次，将液体分散挂在管壁上，再打开管盖吹风。） 

酶切直接在回收 PCR 产物的试管中配置酶切体系。1%琼脂糖回收胶回收（碎胶、酚氯仿抽提法）。 

综上所述，纯化的主要目的就是要去除蛋白质。而酚氯仿混合液能有效地使蛋白质变性，同时抑制 RNAase 的活性，酚氯仿还可以减少酚在核酸溶液中的痕量。所以是一种好东西。