DNA载体构建——【干货】三图让你秒懂质粒图谱

很多人拿到一个质粒图谱，第一反应只能是仰天长啸，这是什么玩意？这些 ori、RBS、tet 是什么鬼？这些箭头代表什么，转录的方向吗？为什么都不相同，不会“撞车"么？ 来，看几张图，上面的问题就能一一破解。

第一步：先了解质粒的基本组成元素。

1）复制起始点 Ori。该位点决定了质粒的宿主及质粒的拷贝数，它是质粒中一段特定序列，富含 AT 和重复序列。

Tips：图谱上只有一个 Ori，表示质粒是原核克隆表达质粒；有两个 Ori，则表示该质粒是，穿梭质粒，即可在原核也可在真核中复制。

2）抗性筛选基因。图谱中 Kan/tet 就是抗生素抗性基因，方便后续通过抗生素筛选阳性克隆。特点就是单词最后会以大写 R 或上标 r 结束。

Tips：一般克隆载体只有一种抗性筛选标记，部分表达载体及穿梭质粒具有两种抗性筛选标记。

3）多克隆位点（MCS），即一系列限制性内切酶酶切位点，是外源 DNA 插入位点，一般可通过酶切/连接方式将外源 DNA 插入质粒，外源 DNA 一般小于 10kb，而片段越长，转化效率越低。

Tips: 一般位于转录启动和转录终止信号之间；所包含的限制性内切酶位点数量和组成因载体不同会有所差异，且其中的酶切位点在质粒中为单一的酶切位点；同时在使用时需注意质粒载体与外源 DNA 酶切位点的兼容性问题荧光标记或蛋白标签序列。蛋白纯化标签蛋白：His-Tag，GST-Tag 等；蛋白检测标签蛋白：Myc-Tag，Flag-Tag，HA-Tag 等；荧光蛋白表达标签：GFP，mCherry 等。

第二步：看质粒是否是表达载体，如果是，那就必定有这些原件：启动子－核糖体结合位 点－克隆位点－转录终止信号。

1、启动子：促进 DNA 转录的 DNA 序列，可与 RNApol 特异性结合。

2、增强子/沉默子：前者是真核基因组中一种增强邻近基因转录过程的调控顺序，其作用与增强子所在位置或方向无关。后者是负增强子，负调控序列。

3、核糖体结合位点/起始密码/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。

4、转录终止顺序（终止子）/翻译终止密码子：结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA  的保守序列，此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区，这 2 部分共同构成 poly（A）加 尾信号。

第三步：弄清楚方向，即为何质粒图谱上有的箭头顺时针而有的箭头逆时针。

其实那是代表两条 DNA 链，即质粒是环状双链 DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的某些基因在另一条链上。当然，最重要的是要弄清楚目的基因插入那一段（从 T7 启动子到终止子那一段）的方向，即下图黄色圈圈所示的箭头方向，其它的大可以忽略。