表达融合蛋白时，如何把两个基因拼接起来？

A君：我要表达一个 ras 加 GFP 融合蛋白，怎么设计引物？

安培君：你的 GFP 标签蛋白在载体里还是要你自己插进去？

A君：是我自己插进去。

安培君：你打算怎样融合？

A君：是不是这样？酶切 A 基因，酶切质粒，把 A 先插入载体，筛选出克隆，然后酶切 B 基因，用不同的酶酶切质粒，将 B 基因插入含 A 的载体。

安培君：No,何必这么复杂，SOE PCR 吧！

A君：什么是 SOE PCR？

SOE PCR 是一种通过寡聚合甘酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行 PCR 扩增，从而获得目的 DNA 基因片段的方法。SOE PCR 可简单地凭借互补引物，通过 PCR 迅速地将两段 基因连接在一起，成为新的杂交基因片段。

若要将基因 A 和 B 连接在一起，假设引物 P1、P2 扩增基因片段 A，引物 P3、P4 扩增基因片段 B；P2、P3 为内引物，P2 上含有 B 的序列，P3 上含有 A 片段的互补序列。单独 PCR 后， P1、P2 将 A 的 3'端带有 B 的 5'端的互补序列，P3、P4 将 B 的 5'端带有 B 的 3'端的互补序列；将各自 PCR 产物混合作为模板，变性退火后，A 链和 B 链结合起来，延伸成新的杂交基因，可以将 A、B 连接起来。

下面以表达融合蛋白 S 和 A 为例，给大家介绍拼接基因 S 和基因 A 的方法,先在 NCBI 中 查找两个基因的 mRNA 序列，然后利用 primer6.0 软件，设计扩增基因 S 和 A 基因的引物， 并去除 S 的终止子和 A 基因的起始密码。

关键问题来了，引物要怎么设计？SOE PCR 引物设计跟普通 PCR 引物有什么不同？ 

*SOE PCR 引物比较长，可长达 80bp，太短要增加反应次数，提高成本。（土豪可忽略） 

*引物有重叠区域，引物间的 overlap region 以 25~30bp 为宜，尽量避免富含 AT 的序列。 

*考虑引物的 TM 值，依照“50℃规则“可以设计出可行的重叠区，但也必须全面考虑其他引物的 Tm 值，在 PCR 的前 5 个循环中，采用就低引物 Tm 值设计退火温度是很好的解决办法。 

*引物长，更要避免自身二级结构、引物二聚体形成等。 在 S 上游引物 5'端加入 EcoR V 限制性核酸内切酶位点，在其下游引物 5'端则加入 BamH I 限制性核酸内切酶位点、含 5 个氨基酸残基的柔性肽基因序列(linker 序列) 以及基因 A 的部分 5'端序列，在 A 基因的上游引物 5 端加入 BamH I、含 5 个氨基酸残基的柔性肽基因序列 (linker 序列)以及基因 S 的部分 3’端序列，在其下游则加入酶切位点 Not I 酶切位点。

S (P1): 5'-ATAGATATC GGAGAA CGG GAT ATG TTT AG-3' 

S (P2)5'- ATA GGATCC ACC GCC ACC GAC ATTGCC AAC GTA TTT TAAG- 3' 

A (P3): 5'-ATA GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCC GCT CAA GTA AT C AAC ACT-3' 

A (P4): 5'-GCGGCCGC CGACAT CCTATC GACCTAAC-3'

划线部分为酶切位点 

接着以 S (P1)和 S (P2)为引物，含有 S 基因的 cDNA 为模板；以 A (P3)和 A (P4)为引物，含有 A 基因的 cDNA 为模板；进行 PCR,得到上述产物并鉴定后，将两者混合作为模板，以 S (P1)  和 A (P4)为引物扩增融合基因 S-A。采用两步法循环模式：第一步将两种模板混合后，在不加引物的情况下循环 3 次；第二步加上引物后，在循环 28 次。

将产物转入载体进行后续的克隆。 引物的结构组成看上去虽然复杂，但设计起来却十分简单，无非就是在普通引物设计的基础上加上重叠区以及一些修饰： 

*Gene S 5’端的修饰，gene A 3 ‘端的修饰，比如增加限制性酶切位点进行克隆和表达。 

*Gene S 3’端的突变，gene A 5’端的突变，比如进行偏嗜密码子的修改、起始密码子的掺入。 

*在 gene S 和 gene A 之间添加 DNA linker。

在应用这一技术时，还有几个要注意的问题： 

*DNA 酶的质量：应避免使用 Taq 酶，因其在 PCR 产物 3 端添加一个突出的 A，从而造成移码，翻译蛋白时全部错位，不好意思今天白忙活，去墙角哭会。因此，为了最大限度地避免碱基的错配，一般采用具有 3‘-5‘外切酶活性的高保真酶，如 TLI DNA Polymerase (Promege)、 KOD DNA Polymerase（Toyobo）、Pyrobest DNA Polymerase (Takara)。比起普通酶，这些高保真酶是贵了点，但真的物有所值。 

*模板的来源： 在构建嵌合 ORF 时，如果选择基因组 DNA 为模板的话，可能会 P 出非翻译 区，宜选择 mRNA 作为原始模板。

*接头序列(Linker)：通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链, 使得融合蛋白中的两种成分能分别形成正确的空间结构、 更好的发挥生物学活性。Linker 序列就像安排一个人畜无害的小伙伴在性格比较暴躁的两人之间，充当和平使者，避免冲突。 

*Mg2+是 DNA 聚合酶活性的依赖离子，Mg2+浓度过低会影响聚合酶活性，过高会造成非特异扩增。SOE-PCR 中：在保证产物扩增效率及特异性的前提下，尽可能降低 Mg2+的浓度， 这可最大限度地提高 DNA 聚合酶的保真性。

今天就分享到这，大家记得要好好消化一下！