RNA反转录又失败了？填坑还得看这六大要素！

老话说的好，万事开头难。而这话在 RT-PCR 中则较为体现出来，其开头的第一步——将 RNA 反转为 cDNA，表面上看似简单，实际上则暗潮汹涌，指不定就在哪里挖个坑，就会让斗志高昂的实验汪们摔的鼻青脸肿，而且还不知道是咋掉坑的。 

显然，RNA 的反转录成功，不是想有就能有。大家之所以屡败屡战、屡战屡败，就是因为忽略了以下这 6 个要素，不然此坑早就被填平，又何至于整日里看着悲催的实验结果唉声叹气呢？

1.RT Primer 的* 

通常 RT primer 可分为三类：oligo dT，随机引物以及基因特异性引物。Oligo dT 引物之所以应用范围更加广泛，是因为可由此获得 mRNA 的全长拷贝。 

然而如果 mRNA 长度过长>4kb，或者没有 polyA 尾（原核 mRNA 或 rRNA），就需要考虑使用随机引物进行 RNA 的反转录。随机引物虽能确保长基因的 5’末端的转录，但并不能获得整个基因全长的 cDNAs，且对 RNA 样品质量要求比较高，此时可用 6-8 个核酸聚合体来提高 cDNAs 的合成量。 

而对于真核生物的 qPCR，长随机引物和 Oligo-dT 引物的混合物似乎能给出一个漂亮的结果。针对此类优化混合引物，已有两家公司的试剂盒或可助大家一臂之力：Qiagen QuantiTect Rev.  Transcription Kit 和 BioRad iScript Kit。 

第三个选择就是基因特异性引物，仅扩增需要的 cDNA，适用于目的序列已知的情况。通常在一步 RT-PCR 法中可使用此类引物，因为该引物也可用作为 PCR 中的反向引物。

2.RNA 的二级结构 

若要获取全长 RNA 的反转录，那么 RNA 二级结构的问题就不可忽略，因为反转录酶在遇到此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。 

也许你很难判断 RNA 是否具有二级结构，但如果基因中 GC 含量较高，通常意味着 RNA 很难被变性且不可能是单链，此时就需要在 65℃ 5min 对其进行充分变性，以避免其对实验结果的影响。 

另外，还有一种方法可解决此问题，即使用一种最适温度高于正常标准（37℃-42℃）的逆转录酶。比如来自 Life Technologies 的 Themoscript 酶就常用于具有复杂结构 RNA 的逆转录。当然也存在一些即使在常规逆转录温度（37℃-42℃）的条件下，也能跨过 RNA 二级结构的高效率逆转录酶，即使是针对富集 GC 序列的 RNA 也能得到很好的结果，如 Qiagen 公司的逆转录酶 Omniscript 和 Sensiscript，以及 Takara Bio 公司的 PrimeScirpt RT enzyme。

3.去除 gDNA 

RNA 中存在的基因组 DNA（gDNA）污染可能是最终 PCR 反应中假阳性结果出现的原因，目前已存在很多方法去除 gDNA，比如通过 DNAase 对提取的 RNA 进行预处理。 

以上方法无可避免会造成 RNA 的蛋白污染，因而这里介绍一种可绕开酶处理的方法，即针对 RNA 设计一种包含内含子或内含子-外显子边界的引物，如此 DNA 就不会产生扩增抑或即便扩增了其条带大小也与 cDNA 不同。 

但值得注意的是，使用该方法时基因中要没有假基因存在，假基因（pseudogene）是插入到基因组中剪切 mRNA 的 DNA 拷贝，否则也会产生假阳性结果。 

而对于没有内含子的原核 RNA，gDNA 的去除则更是基因表达准确测量的一个至关重要的因素。使用 DNAase 处理 RNA 是*的方法，Quantitect Rev.Transcription Kit 中所包含的 gDNA 清除缓冲液就可在无需加热或 EDTA 失活的条件下降解 DNA。此外，具有 gDNA Eraser（Takara  Bio）的 PrimeScript RT 试剂盒也可去除 gDNA，且能在不到 20 分钟之内快速完成 RNA 的 cDNA 合成。

4.检测 RNA 分子的完整性 

毫无疑问，RNA 质量对 cDNA 合成结果会产生重要的影响，而不同批次间 RNA 质量差异也导致 RT-PCR 产生不同的结果。所以在进行 RT-PCR 前，应该检查 RNA 条带的质量，可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。通常完整的真核 RNA 应包括 28S 和 18S RNA 条带，且较大的条带的强度应是较小条带的两倍左右，另外两个条带强度大致相同也是可以的。 

而另一种准确测量 RNA 质量的方法是使用 Agilent BioAnalzyer 仪器，它可将 RNA 分子可视化并能在分析 RNA 完整数值（RNA Integrity Number，RIN）后给出一个质量的量化标准。RIN 为 8-10，则表示 RNA 质量非常好；当 RIN 值低于 7，则说明 RNA 可能有降解，可能会导致一些罕见信息的丢失等问题。

5.RNA 定量 

除了掌握 RNA 的完整性之外，准确评估产量也很重要。产量的准确性会受到以下因素的影响：测量仪器的准确性、DNA 的污染、盐的污染以及降解程度。而为了准确测量产量，小编我更喜欢使用 Nanodrop 进行 UV 定量。 

该仪器不需要稀释样品，并且具有非常宽的测量 RNA 的范围。以小编的经验，它可以准确读取到 10ng / ul。而传统的紫外分光光度法应避免使用大容量的比色皿，因为这需要耗费大量的样品。此法的缺点是也可在样品中测量基因组 DNA，如果从 RNA 提取过程残留盐或酚，则会增加吸光度，使得 RNA 的 OD 值变得更高。 

而解决此问题一个方法是使用荧光染料，Ribogreen 是一种 RNA 特异性染料，可通过荧光来测量 RNA 产量。现在，Nanodrop 已经具备检测 Ribogreen 所发出荧光的功能。

6.两步法或一步法 RT-PCR 

RT-PCR 也分两种类型：一步法（One-step PCR）和两步法（Two-steps PCR），具体操作见下图。前者，RT 反应和 PCR 扩增是在同一个反应管中进行的；而后者，RT 反应与 PCR 扩增反应单独进行。

尽管这两种方法都能得到最终的结果，但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。 

一步 RT-PCR 消除了样品转移步骤，不仅消除了控制物污染的潜在来源，而且需要较少的准备和操作时间。又因一步 RT-PCR 中所使用的引物是基因特异性的，灵敏度高，常用于分析低表达水平基因。而其不足在于同一样本中只有有限数量的目的基因被扩增，且需要在转录和扩增间寻找一个平衡。 

所以当时间对实验很重要时，一般采用一步法，如检测 RNA 病毒，也适用于高通量分析。由于该法的检测结果准确率高，因而在需要测量表达水平上的细微差异时，也可采用此方法。 

而两步 RT-PCR 可将大批量的 RNA 转化为 cDNA，然后储存 cDNA 用于后续实验，可检测大量基因；在分别优化 RT 和 PCR 步骤后，可更好地控制实验过程；又因只有少量的转录本被用 于 PCR，则任何可能从 RNA 分离到 RT 反应的抑制剂（如乙醇、酚及胍盐等）都被稀释了。 

但是两步 RT-PCR 更耗费时间，且带来污染的可能性更高；RT 过程应以相同效率反转录 RNA， 否则会影响 qPCR 的启动效率，进而带来不同的实验结果，因此对于每个 RT 反应应使用相同的条件。 

如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时，可选择两步 RT-PCR。另外，当 RNA 的存储是个问题时，最好是进行两步 RT-PCR，因为 cDNA 在-20℃是稳定的。

参考文献：

1、Six Important Factors for Successful Reverse Transcription 

2、How to Choose the Correct Reverse Transcription Method