【RNA提取】RNA抽提的三大纪律八项注意！

今天我们谈一谈 RNA 抽提的问题。为了方便大家记忆，总结出了“三大纪律八项注意"。

纪律一：无外源酶的污染。 

外源酶会造成 RNA 的降解，造成 RNA 得率太低，或者*失败。而外源酶又是无处不在的。这就要求注意以下三点：

注意一：严格戴好口罩，手套。手指和呼吸时重要的外源酶的来源。所以童鞋们做 RNA 抽 提的时候，还是要全副武装起来。这对自己也是一种保护措施。 

注意二：实验所涉及的离心管，枪头，移液器，实验台面等要*处理。离心管和枪头要用 DEPC 处理过，单纯的消毒灭菌可不行呀。移液器和实验台面等要用 75%的酒精擦过。 

注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。

纪律二：无内源酶的活性。 

这个和纪律一是一脉相承的。目的都是减少 RNA 的降解，提高最终的得率。而所有的组织都含有内源酶，这就要求我们在实验过程中，千方百计灭活内源酶。这也就诞生了下面的四大注意事项： 

注意四：选择合适的匀浆方法。新鲜样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃ 冰箱保存。在碾磨前，碾磨用具也必须预冷。在碾磨过程中，一边碾磨，一边补充液氮。样品碾碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。

注意五：选择合适的裂解液。现在市场上常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性。但是，高内源酶含量的样品，如肝脏，脾脏等组织，建议使用含苯酚的裂解液。苯酚的灭活内源酶的能力是很强的。 

注意六：控制好样品的起始量。如果样品的块头太大，所有的细胞无法迅速和裂解液接触。里面没有接触到细胞的 RNA 很快就会被内源酶降解。所以，起始量不要太大。如果块头太大，要把它切成小块小块的。

纪律三：明确抽提目的。 

我们做每一个实验，甚至每一个步骤，都要清楚这样子做的目的是什么。RNA 用于不同的实验，其质量的要求是不一样的。那么，这就诞生了下面的最后两条纪律： 

注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。所以，要进行样品的破碎和匀浆。其目的是为了使 RNA *地完整地释放出来。如果样品是细胞，则无须破碎即可直接匀浆；如果是组织，甚至器官，那就需要破碎后才能匀浆；如果是酵母菌和细菌，则需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。

注意八：RNA 抽提成功的一个经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。我们为什么要抽提 RNA？是为了后面的实验，例如原位杂交，免疫沉淀等等。所以，一定要明确后面到底是要干嘛？cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶 反应抑制物残留要求严格。不用每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，从而造成不必要的浪费。

综上所述，对大部分实验者来说，RNA 抽提比 DNA 抽提要困难得多。所以，我们要个个牢记，三大纪律八项注意。