【干货】RNA抽提原理和流程

现在我们所熟知的 TRIzol 是 Life Technologies 公司的商品名，而同样的试剂在 Piotr  Chomczynski 创办的 MRC 公司则被命名为 RNAzol（据 Piotr Chomczynski 透露，他们已经将 RNAzol 改进，使抽提得到的 RNA 无基因组 DNA 残留）。事实上，这种 RNA 抽提的方法应该叫做“异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法"。

TRIzol 作用原理： 

在匀质化或溶解样品中，TRIzol 试剂可保持 RNA 的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。RNA 存在于水相。水相转移后，RNA 通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇沉淀可从中间相得到 DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。

需自备的耗材试剂： 

o RNase free 的一次性带盖透明聚丙烯管 

o RNase free 的枪头 

o RNase free 玻璃瓶：玻璃瓶 200°C 烘烤 2h 即可去除 RNase，塑料瓶盖可浸泡 10 分钟 的 0.5 M NaOH 溶液，然后用 RNase free 水*冲洗，并高压蒸汽灭菌。 

o 氯仿 

o 异丙醇 

o RNase free 水：即 DEPC treated 水。把水加入 RNase-free 玻璃瓶中，加入 0.1%（v/v） DEPC 用力摇匀，37°C 过夜，高温高压灭菌。灭菌时瓶口需拧松，DEPC 受高温会分解出大量 CO2，注意安全！ 

o 75%乙醇（无水乙醇溶于 RNase free 水中）

简明抽提流程： 

裂解 

a) 新鲜取材的组织液氮急冻后，每 50-100mg 组织加 1ml TRIzol，使用强力匀浆机匀浆；

b) 贴壁细胞则弃培养基后每 87.5px 皿中加入 TRIzol 试剂 1ml 吹打裂解； 

c) 悬浮细胞则离心沉淀细胞弃培养基，每 5-10×106 个细胞中加入 1ml TRIzol 吹打裂解。

Tips：使用 TRIzol 试剂前避免洗涤组织和细胞，因为这增加了 mRNA 降解的可能性。

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室温孵育 5-10min 

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每 1ml TRIzol 中加 200ul 氯仿，用手大力摇管 15s， 室温孵育 2-3min 

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2-8°C、12000 g×15min

离心后，混合物分离为下层红色的酚-氯仿相、中间相以及上层无色水相。RNA 存在于水相。

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转移水相到一个新管，加入 500ul 异丙醇上下颠倒混匀，室温孵育 10min 

Tips：转移水相时，枪尖随着液面下移而下移，避免扰乱分层，慢慢吸取，避免吸到中间相和下层有机相，更不要贪心吸太多，吸大约 400ul 就好。 

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2-8°C、12000 g×10min 往往离心前 RNA 不可见，离心后再管侧面和底部形成白色沉淀 

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弃上清，1ml 75%乙醇洗涤一次，2-8°C、7500 g×5min

Tips：加入 75%乙醇时轻轻加进去就好，尽量不要把 RNA 沉淀吹散，把沉淀保持在原位最好了，因为有时候 RNA 太少，吹散了再离心下来时 RNA 碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可见的沉淀，导致后面的“盲操作"。而不小心吹散的话也没关系，对 RNA 质量不会有影响。

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尽量吸除上清，室温干燥 5-10min，以 RNase free 水溶解，并保存于-70°C 

Tips：密切注意 RNA 沉淀的干燥程度，不要*干燥，这将大大降低其溶解度。部分溶解的 RNA 其 A260/280 比值会偏低。最佳干燥度为 RNA 沉淀仍然是白色的，微微湿润呈啫喱状。

OK，搞定！