RNA Trizol 抽提步骤

PCR、qRT-PCR 最最初始，都离不开 RNA 的抽提，RNA 质量的好坏，直接影响到后续的反转录及 PCR 等过程。很多时候，小伙伴们明明跟着 Trizol 步骤一步一步来的，谨小慎微，不敢懈怠，但就是 RNA 抽提不过关。其实 Trizol 抽提 RNA 是个细活儿，小伙伴们根据自身的实战经验，做一下优化很有必要~ 

Trizol 标准抽提步骤（打勾勾的自然是要注意的地方）： 

1、将裂解后样品或匀浆液室温放置 5-10 min，使得核蛋白与核酸*分离。 

✔样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以 12,000  rpm 离心 10 min，移去漂浮的油脂，取上清。 

2、加入 0.2 ml 氯仿，剧烈振荡 15 sec，室温放置 3 min。12,000 rpm 4°C 离心 10 min。 

✔如不能旋涡混匀，可手动颠倒混匀 2 min。 

✔样品会分成三层：上层水相，中间层和下层有机相。RNA 在上层水相中。 

3、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置 20 min。 

✔不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体 DNA 污染。 

4、12,000rpm 4°C 离心 10 min，弃上清。

✔离心前 RNA 沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。 

5、加入 1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。12,000 rpm 4°C 离心 3 min，弃上清。室温干燥 5-10 min。 

✔75%乙醇用 DEPC 处理过的水配制。 

✔通常 1 ml Total RNA Extractor 需用 1 ml 75%乙醇洗涤沉淀。 

✔不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，不要吸沉淀。 

✔不要晾的过干，RNA *干燥后很难溶解，大约晾干 5 min 左右。 

6、加入 30-50 µl RNase-free ddH2O，充分溶解 RNA。将所得到的 RNA 溶液置于 -70°C 保存或用于后续试验。 

✔对于肝、胰腺、肾等组织中 RNase 含量很高，沉淀用 100%去离子甲酰胺溶解。

额外的小 TIP~（第三步）： 

很多刚开始学抽提的小伙伴吸取上层水相总是吸到中间层物质。既然吸上层手容易抖，那不妨吸下层遗弃然后把剩余的再进行离心。这样多一步，离完心剩下的基本就是上层水相和中间层沉淀，再吸取想要的目标就能轻松改掉手抖啦～ 

Protocal 改善的地方~(还是第三步)：

3、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入 2.5 倍体积乙醇，1/10 倍体积 3M 醋酸钠，以及糖原。混匀，-80°C 放置 30-60min。

✔不要吸取任何中间层物质，否则会出现染色体 DNA 污染。 

✔加入糖原，使溶液中糖原的最终浓度达到 50ng/µl。 

✔混匀后，-80°C 放置 30 -60min，适当增长孵育时间或者降低孵育温度将有助于小 RNA 的沉降。 

✔以取 500µl 上层水相为例，则需加入 1250µl 乙醇，50µl 醋酸钠以及 4.5µl 糖原原液（原液浓度为：20mg/ml）。