【技术】教你如何达到提取RNA的最高境界！

免除 RNase 的困扰 

RNA 分子异常脆弱，很容易就会被无处不在的 RNase 降解，轻轻松松的就让实验人员的种种努力付之东流。尤其是当样品极其稀少且珍贵时，RNA 的降解更是让各位小伙伴们想自挂东南枝。因而 RNase 可谓是 RNA 提取的大敌，那么为了保护好 RNA 分子，就必须 把 RNase 给 KO 掉。

当然针对外来的敌人，只要注意这三个小细节，那么绝对可以克敌制胜。 

（1）严格戴好口罩、手套。手指和呼吸是外源性 RNase 的主要来源，所以在提取 RNA 时，一 定全副武装起来，才好擒获 RNA 分子。 

（2）实验中所涉及的离心管、枪头、移液器、实验台面一定要经过*处理。比如，离心管和枪头要用 0.1%DEPC 浸泡后并高压灭菌处理，移液器、实验台面要用 75%的酒精擦拭过， 玻璃器皿应在使用前用 180℃的高温下干烤 6h 或更长时间。 

（3）实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。另外，还需要注意 RNA 的保存时间，一般 RNA 37℃稳定存放 1 天，25℃稳定存放一周，4℃可存放一个月或-20℃长期存放。

可是有时即便小伙伴已经如此小心翼翼了，RNA 分子仍会消失的无影无踪，细究其原因，才发现竟是内源性 RNase 在搞鬼，这不禁让人感叹道，不是我们太粗心，实在是敌人太狡猾。为了打击内源性 RNase 的嚣张气焰，我们只能千方百计的灭活内源酶，因而便诞生了以下三个妙招。

1、选择合适的匀浆方法。新鲜样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可移至-70℃冰箱中保存。在碾磨前，碾磨用具也必须预冷。在碾磨过程中，一边碾磨，一边补充液氮。样品碾碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 

2、选择合适的裂解液。现有市场上常用的裂解液几乎都能抑制 RNase 活性。但是高内源酶含量的样品，如肝脏、脾脏等组织，建议使用含苯酚的裂解液。苯酚的灭活内源酶的能力还是很强的。 

3、控制好样品的起始量。如果样品的个头太大，细胞中就会有些“漏网之鱼"免于和裂解液接触，致使 RNA 很快就会被内源酶降解。因而，起始量不要太大，如果组织块过大，可以将切碎后再抽提 RNA。

明确抽提 RNA 的目的 

一般，抽提 RNA 的目的无外乎有两个。首先，最直接的目的就是要让 RNA *地完整的释放出来。此时对样品的处理就至关重要，如果样品是细胞，则无须破碎即可直接匀浆；如果是组织甚至器官，那就需要破碎后才能匀浆；如果是酵母菌和细菌，则需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。 

其次，RNA 在不同的实验中其质量的要求是不一样的，那么后续实验就是我们必须要考虑的。通常 cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。因而，不用每次实验都以获得最高纯度的 RNA 为目的，从而造成不必要的浪费。

RNA 提取之疑难杂症 

1、RNA 产量低

2、OD260/OD280<1.6

3、基因组 DNA 污染

4、RNA 降解

5、下游的 RT-PCR 实验不成功

RNA 电泳图谱剖析 

提取RNA后，为了更好的进行后续的实验反应需要通过琼脂糖电泳来判断RNA质量的好坏。在此，将剖析电泳图上的秘密，帮助大家提高 RNA 抽提的成功率。

1、RNA 条带不亮或缺失

原因分析：（1）上样量不足。（2）RNA 跑出凝胶。电泳至溴酚蓝至凝胶的 2/3 即可停止电泳。（3）RNA 在凝胶中发生扩散。避免长时间的电泳，否则小片段容易扩散。（4）RNA 降解。最大限度减少在紫外线下暴露的时间，使用新鲜的电泳缓冲液、新制的凝胶，电泳槽及制胶的模具梳子等用双氧水浸泡，高电压短时间电泳（20min）。也可能使用的组织材料不够新鲜（冷冻的材料必须在化冻之前将其磨碎）。

2、RNA 条带弥散

原因分析：（1）RNA 被核酸酶降解。要用新的缓冲液，制胶用的模具要清洁，枪头要灭菌。（ 2）电压过高造成电流过大所造成的。一般为 5—8V/cm。为了增加条带的清晰度，电泳开始的几分钟建议使用低电压。（3）上样量过大。根据沉淀量的多少确定点样的量，一般 1—3ul。

3、点样孔发亮

原因解析：（1）上样量过大。（2）胶孔未凝固好，使样品无法往前移动。（3）RNA 样品中含有污染物，如残留的蛋白质容易引起此现象。可能 trizol 量太少，应加大 trizol 用量。另外若残留 DNA 也应考虑加大 trizol 用量。

4. 出现多条带

原因解析：（1）RNA 降解。提取过程中出现降解或电泳过程中出现降解（可能性较小）。（2） 上样量过大。RNA 由多种类型组成，若上样量过大则会导致各种类型的 RNA（tRNA，mRNA 等）均会出现条带。