酵母杂交实验——从一无所知到略知一二

低分文章要想逆袭，实现向高分文章的跳跃，就一定少不了要将细胞豪门中分子间错综复杂的关系屡屡清楚。为了找寻能让自家目的蛋白荣登科研“头条榜"的“花边新闻"，一众科研者可谓是操碎了心。庆幸的是，酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）和酵母单杂交（Yeast One-Hybrid，Y1H）实验让蛋白质与其好友（蛋白质、DNA、RNA）的关系在科研者面前变得无所遁形。

蛋白钓鱼术——酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）

通常一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白，但最终还是会有个最喜欢的，而在 Y2H 中就能发现他的喜好。换言之，Y2H 就是研究一群男女间的自由恋爱问题，而它为两个蛋白牵线拉桥的方法，简单概括起来就一句话：广撒网，钓大鱼。

首先，把目的基因构建成 DNA 结合质粒（BD 质粒）转入 a 型酵母中形成钓饵（Bait）；其次将全 cDNA 片段构建的转录激活质粒（AD 质粒）转化到 b 型酵母中，每个 b 型酵母含有一个随机的 AD 质粒，就形成了酵母库；最后利用酵母接合生殖的特征使得 AD 和 BD 两个质粒 同时进入到一个酵母中，当目的蛋白和酵母库中 AD 质粒所表达的蛋白相“合拍"时，质粒上的氨基酸合成基因就会被启动激活，使得酵母可以在营养缺陷型的培养基上生长了，这样就 弄清楚谁才是目的蛋白的“命中真爱"了。 

然而在 Y2H 中，由于酵母库的构建是通过 cDNA 片段链接到质粒上的，经常会产生 2/3 移码突变的假阳性。因而，在研究蛋白质互作过程中，在用 Y2H 来筛选出相关蛋白后，还需用 Co-IP 和 GST pulldown 进行验证，看看目的蛋白对“真爱"是否做到了“没有你不行"又或者可能“脚踏两只船"还拥有其他的新伙伴。总之，只有依靠缜密的阴性、阳性对照才能真正在蛋白实验中披沙拣金、去伪存真。

DNA 识别者——酵母单杂交（Yeast One-Hybrid，Y1H）

而一提及蛋白质与 DNA 之间千丝万缕的关系，各位小伙伴立刻会向 ChIP-qPCR，ChIP-RNAseq 或荧光素酶报告实验等“神助攻"来寻求帮助。 

可是你造么？通过酵母单杂交（Y1H），可快速鉴定与感兴趣的特定调节 DNA 序列（bait 序列）相互作用的蛋白质，除了“明星蛋白"异源转录因子，还可找到一些其他“幕后英雄"，如 DNA 复制蛋白、修复蛋白及抑制蛋白。更重要的是，Y1H 还有着一项得天独厚的优势：可检测蛋白异构体（isoform）与 DNA 特异性相互作用，而这正是依赖于敏感和特异性抗体绑定到特定靶蛋白的 ChIP 很难做到的。

举个栗子，当通过各类芯片筛选出了一个在肿瘤组织中异常高表达的差异基因 A，可通过 Y1H 实验为其组织一场相亲大会：即将构建含有报告基因（基因 A 作为 Bait 序列）的酵母单细胞株，与后续导入该菌株的表达特定蛋白的表达质粒库“见面"，如果某蛋白能与上游的 Bait 序列“情孚意合"，可使融合激活结构域（AD）与报告基因的启动子元件紧密接近，从而激活报告基因的下游转录，使得酵母可以在营养缺陷型的培养基上生长。接下来就可对该蛋白调控基因 A 的机制进行深入研究。 

然而，任何筛选都存在假阳性，Y1H 也不例外；且 Y1H 不提供关于 DNA-蛋白质相互作用的功能性后果的任何信息。可见在生物实验中，单一的证据都是薄弱的，无论它貌似多么正确，也要通过对照和多方取证才能确定真正的事实。 

升级版——酵母三交技术（Yeast Three-hybrid，Y3H）

目前，从基本科学和临床角度上，通过 Y3H 来理解与 RNA 病毒相关的疾病过程是很重要的。而在具体的实践过程中，Y3H 可以用于筛选 RNA 文库以及 cDNA 文库。由于 Y3H 在现阶段还是一种新技术，所以迄今为止对其的相关报道还是比较少的。

参考文献： 

1）An Overview of Yeast Two-Hybrid (Y2H) Screening 

2）An overview of the Yeast one-hybrid assay 

3）Two Hybrid Services