免疫组化之8大疑难解答

IHC 常见的 8 大疑问

Q1：冰冻切片和石蜡切片如何取材？ 

Answer: 冰冻切片取材可分为两种情况：1）动物灌流固定：如小鼠心脏灌流，首先采用预冷的 1×PBS 灌流冲洗直至血液全部放出，随后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直，而后解剖获取组织，于 4℃、4%PFA 中固定 1h 左右，1×PBS 洗 5 次（30min/次），25%蔗糖溶液脱水 12h 左右包埋即可。 2）直接取材：直接选择新鲜组织进行冰冻切片，此时不需要进行抗原修复。缺点：切出的片子含水量会比较多，形成冰晶影响结果，而且后期的丙酮固定也会改变细胞的形态。石蜡切片：动物组织取材（灌流与否都可以，并不影响后续的操作）后，置于 10%福尔马林溶液中固定 3-4 天后，脱水，包埋，即可进行石蜡切片操作。 

Q2:石蜡切片和冰冻切片的区别比较 

Answer: 1）石蜡切片制备过程较复杂，抗原活性差，但切片薄（3-5μm），便于观察细胞的细微结构，且常温保存即可，非常方便。2）冰冻切片较厚（8-12μm），操作简单，抗原活性好， 但是保存时间短，且一定放在-80℃的低温冰箱中。

Q3：一抗的选择要点是什么？ 

Answer：1）一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低；而多克隆抗体特异性弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可通过封闭来避免）。2）抗体的比例可依据抗体说明书或 western blot 的抗体比例来做即可。3）对于组织样本，一般要在 37℃孵育 1-2h 或 4℃冰箱孵育过夜（效果较为佳，且拿出后需 37℃复温 45min），并保持湿盒里的湿度来防止抗体蒸发。对于难以着色的，在第二天还需将湿盒置于室温孵育。

Q4：如何选择封闭血清？ 

Answer：封闭血清一般是和二抗同一来源，可封闭非特异性结合位点，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能与一抗的来源一致。

Q5：DAB 显色时间如何把握？ 

Answer：可选择一张阳性的片子，用计时器精确计时在显微镜下判断出具体时间后，再对所有片子进行显色，采用相同的时间来界定。一般如果抗体浓度适宜，操作无误，10 分钟内肯定能够显色，如果超过该时间，说明一抗比例不够或者封闭太久等等原因。显色时间越短，则说明抗体浓度高或抗体孵育时间过长，需下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间。

Q6：IHC 复染时间的选择？ 

Answer：苏木素复染时间一般为 5min 左右，可调整，染色时间太浅，可延长时间，反之缩短时间；随后进行盐酸酒精分化，数秒即可，自来水洗，最后置于氨水中返蓝。

Q7：免疫组化的结果如何分析？ 

Answer：1）必设对照组。如阴性、阳性及自身对照。

由表中可知，只有 6、7 实验结果有意义。1-5 均因对照组的结果已否定抗体的特异性或因 ICH 技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，则必须重复实验或换用抗体。 2）阳性着色细胞计数法。在 40 倍光镜下，随机选择不重叠的 10 个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组 3-6 张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。 3）灰密度分析法。通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用 image j 进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。 4）分级法。免疫组化的半定量一般分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察 5-10 个 HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 计算出数值；总数值<1.0 者为（+），1.0-1.5 者为(++), >1.5 者为(+++)。

Q8：IHC 常见的疑难杂症有哪些？ 

Answer：