ELISA实验中常遇到的问题、产生的原因与解决办法

酶联免疫吸附实验，简称为 ELISA。ELISA 实验是一种非常经典的免疫学实验。虽然历史非常悠久了，但是还是不断地在临床和基础研究中得到应用。其主要用于：免疫酶染色各种细胞内成份的定位；研究抗酶抗体的合成；显现微量的免疫沉淀反应；定量检测体液中抗原或者抗体成份。小编总结了一些经验教训。遇到的问题，可能的原因，解决方法。供大家参考。

问题 1：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阴性颜色太深。

可能的原因：阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中有某种成分与一抗作用。

解决的方法：纯化抗原除去干扰成分。

问题 2：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阳性颜色太浅。

可能的原因有 3 个： 1）一抗效价不好。 2）抗原太稀。 3）封闭时间过长。

解决的方法： 1）换用一抗或增加一抗用量。 2）增加抗原浓度。 3）缩短封闭时间，封闭时间一般 37 摄氏度 3 个小时，或者 4 摄氏度过夜。不能比这个更长了。

问题 3：增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度。

可能的问题： 一抗与抗原的比例已经饱和。

解决的方法： 增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。

问题 4：增加一抗浓度，显色反应没有表现出应有的梯度。

可能的原因：一抗与抗原的比例已经饱和。

解决的方法：增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。

问题 5：加完 TMB 显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了。

可能的原因：硫酸可能把其它成分都炭化了。

解决的办法：加少一点硫酸，参考值：50 μlTMB+35 μl 硫酸；或者采用 1M 的 HCL 作为终止液，50ulTMB+50ul1M HCL。

这些步骤里面，一抗和封闭是两个关键。如果 ELISA 做不出满意的结果，首先应该从这两个方面改进。Elisa 实验看似简单，其实不然。别小瞧了ELISA。光是一个加样就有很多讲究。

ELISA 中加样须注意如下问题：

吸取样品时，加样枪吸头不应黏附多余的液体；加样时不可 90 度向孔中滴加液体，这样会导致液体残留在吸头上，加样不准确！ 不要将吸头伸入孔中，一方面若接触孔底可能压弯吸头，另一方面可能会将孔中的液体吹起来，加样不准确！ 正确的加样方法应为 45 度，吸头贴着孔壁加入，应注意： 角度太小，会使液体残留在孔壁上，导致加样不准确！ 吸头应当贴着管壁和液面的交界处！

综上所述，Elisa 实验看似简单，其实还是有很多细节需要我们注意的。以上介绍了 Elisa 实验的一些经验教训，希望对大家有所帮助。