蛋白样品的制备与定量

（1）提细胞蛋白 

① 消化或刮下细胞至 1.5 的 EP 管中，标记，10000r 离心 2min，PBS 洗 3 遍

② 吸去 EP 管中 PBS，最好用滤纸吸干里面的水分，加适量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液：蛋白酶抑制剂=250:1），如果你想做信号通路指标还得再加上磷酸酶抑制剂（磷酸酶抑制剂： RIPA 裂解液=1:1000） 

③ 冰上裂解 30min~1h，开 4°离心机 

④ 4°离心 11000r，20min 

⑤ 测蛋白浓度，取上清，加蛋白上清的四分之一体积 5x 上样 loading buffer，煮沸，分装（蛋白质变性）

（2）提组织蛋白 

① 研钵中倒入液氮，加入组织块，研磨，加液氮，药匙刮 

② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管，加适量裂解液，吹打 

③ 冰上放置 1h，期间，每隔 10~15min 吹打一次，开 4°离心机 

④ 4°离心 10000r，1h 

⑤ 测蛋白浓度，取上清，加 1/4 体积 5x loading buffer，煮沸，分装

（3）测蛋白浓度（BCA 法） 

① 八个标准孔，按说明书先加超纯水，再加标准蛋白液 

② 目的孔，每孔加 18ul 超纯水+2ul 目的蛋白 

③ 按说明书配 BCA 工作液，每孔加 200ul 

④ 37°放置半小时后测浓度

（4）计算上样量，设计上样顺序 

上样体积：上样量/浓度 x 5/4

上样顺序：无处理，对照，处理；体积最好不要相差太大

经验总结： 

如何提高蛋白浓度：首先当然是多种点细胞啦，其次可以少加点裂解液，尽量裂解充分。如何处理蛋白浓度低的问题：实验过程中发现蛋白的浓度太低，如果上样的话，体积太大，甚至电泳孔都装不下，举例：假设我需要上样 40ul 才能达到 20ug，那么显然按照常规的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我们此时可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 仪器，变性温度浓缩蛋白体积，这样不断浓缩之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依旧是 20ug。如何保证对照组和实验组蛋白浓度大概是一致的：种植细胞的时候尽量保持铺下去的细胞数接近，收细胞之后观察细胞的多少适当加入几倍体积的裂解液。