WB的免疫印迹操作分享

①膜处理（甲醇 1min，风干（放滤纸上），甲醇 1min，水 1min） 

② 封闭（用 TBST 配 5%牛奶）1h 配摇床 

③ 加一抗，牛奶稀释,所需浓度参考抗体说明书，看膜的大小配多少一抗，4°过夜。 

④ 室温孵育 20min 

⑤ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床（0.1%TBST：tris12.1g，NaCl87.66g，HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后，加入 1ml 的 TWEEN20） 

⑥ 加二抗，牛奶稀释，一般 1:10000，1h 配摇床 

⑦ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配摇床 

⑧ 发光（A 液 B 液等体积混合，孵膜 1min，正面朝上放入仪器内发光）

经验总结： 

封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用 BSA，而且封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况 5%BSA 的效果会比 5%牛奶要好。 信号通路一般都是用 5%BSA 封闭。 信号通路在洗膜的时候用快速摇床 5min/次 3 次就可以了。 如果你想省时间，一抗可以放在 37℃1~2hour，但是一定要封好，以免温度太高而导致抗体 干了出现假阳性。二抗可以 37℃半个小时。 发光液的选取，如果是一般的抗体，建议用一般的发光液效果会好一点，如 keygen 的，背景会比较干净。但是一些难发出来的一般建议用灵敏度更高的发光液如 FD 的或者是 MILLIPORE 之类的发光液。