如何优雅地获得漂亮小分子蛋白条带

做过 Western-Blot 的童鞋知道，分子量小于 30KDa 的蛋白分子不容易做。小分子蛋白虐我千百遍，我待小分子蛋白如初恋。抱怨是没用的，想方设法解决问题才是正道。一次又一次的调整方案，一次又一次的徒劳无功。在此，总结了小分子蛋白之路经验，供有需求的童鞋参考。

一、提蛋白的过程在 30 分钟之内完成，提完蛋白立即加入上样缓冲液煮沸（煮沸的时间长一点，一般 20 分钟），准备好蛋白样品后立即电泳。（小分子蛋白容易形成多聚体，这样可以大大减少多聚体的形成）。

二、电泳时，电泳的时间要足够长。习惯是先用 60-80V 电压跑完浓缩胶，再以 100-120V 电压跑分离胶，溴酚蓝电泳至玻璃板底部。伯乐系列的电泳槽一般电泳 2 个小时左右，GE 以及百晶系列的电泳槽要电泳 4 到 5 个小时。电泳时要在冰水浴中进行。最好用 1mm 和 1.5mm 厚的胶（若用 0.75mm 厚的胶时要适当缩短转膜时间）。

三、转膜时，尽量用湿转法（半干转也可以，但是容易转过）。转膜缓冲液中，甲醇浓度要达到 20%。PVDF 膜，财大气粗的土豪可以用 0.22 微米的膜。对于我们大多数穷人来说，0.45 微米的膜也是可以的。以下是摸索出来的转膜时间（湿转法，0.45 微米的膜），供大家参考。

四、一抗孵育因为多数小分子蛋白的表达量较少，所以我一般孵育至少 48 个小时，甚至孵育 72 个小时。以上方法适用于分子量在 20-30KDa 的蛋白。若蛋白分子量小于 15KDa，则不用 SDS-PAGE 凝 胶电泳（蛋白与 SDS 共迁移，影响分离度，得不到很好的分离效果），应该采用 Tris-Tricine 缓冲系统与 Tricine 分离胶。具体操作步骤见《精编分子生物学实验室指南》338-340 页（这本书每个实验室必会备，若没有，可以在孔夫子旧书市场上买一本）。

需要注意的是，Tricine 电泳时，蛋白样品用 Tricine 样品缓冲液处理，加样前在 37-40℃沙浴中处理一个小时（不要煮沸！不要煮沸！不要煮沸！重要的事情说三遍）。内槽中加满阴极缓冲液，外槽中加满阳极缓冲液（千万不要加反了。否则蛋白全部进入缓冲液！）。 

最后，祝做小分子蛋白的童鞋实验之路顺利，早日做出满意的结果。