如何在WB中顺利获取大分子蛋白？

分子量大于 150Ka 的蛋白，经常折磨我们实验人。想当初，辛辛苦苦忙到深夜，结果发现显影空空如也。连续几个月如此，内心是何等抓狂。当大分子条带第一次出来的时候，心里特别开心，就像见到了初恋情人一样。看到周围有同仁受困于大分子蛋白，想一想当初所面对的困境。 

在此,分享一下大分子蛋白的心得，希望这些经验对那些与大分子蛋白奋战的童鞋提供帮助。 

提蛋白时应加入 RIPA 强效裂解液，在 4℃环境下静置的时间延长十分钟到二十分钟。这样可以充分裂解大分子蛋白（裂解不充分，大分子蛋白的电泳速度会很慢）。电泳时，电泳的时间要足够长。

电泳全程采用 120-150V 的高电压，使 Marker 拉开足够大的距离。电泳时要在冰水浴中进行。 

转膜时，湿转法与半干转法均可以（湿转法获得条带漂亮。半干转转膜效率高），转膜时，要保留分离胶（好多分子量超过 250KDa 的蛋白就残留在浓缩胶中！这是血的教训！当初好 几次傻傻的把浓缩胶扔了，结果神马条带都没有！）。

先说湿转法，转膜缓冲液中甲醇浓度最高 10%，加入 SDS，使 SDS 终浓度达到 5%（大于 300KDa 的蛋白，转膜液中 SDS 的终浓度可以到 10%)。以下摸索出来湿转法的转膜时间（曾经试验过 30mA 小电流转膜过夜的方法，PVDF 膜上神马都没有。建议大家不要尝试！）。

用半干转时转膜效率高。恒压模式设置为 40V 电压，转膜 60-90min。一般小于 400KDa 的蛋白都能转到 PVDF 膜上。 

或者用恒流法转，电流大小设置为 PVDF 膜的面积，转一个小时左右就可以出来。若怕转膜过头，可以将两张 PVDF 膜重叠起来（总会有一张膜上有条带）。 

因为多数大分子蛋白是膜蛋白，表达较少，建议延长一抗孵育时间。有一次甚至孵育了四天才出结果。大分子蛋白与 PVDF 膜的结合不是很牢固，容易脱落，因此在洗膜时要操作轻柔，不要过于粗暴，否则抗原抗体复合物容易脱落。 

这些经验是从几百次失败的实验中总结出来的，希望对大家有所帮助。实验失败不可怕， 重要的是要勇于面对，仔细思考，敢于改进。

最后，祝大家实验顺利，早出漂亮结果！