清晰的条带是这样跑出来的——western blot八大秘诀！

1.制胶：

先制分离胶，再制浓缩胶，严格按照制胶说明书来就可以了。需要注意的一点是制胶一定要混匀！混匀！混匀！个人经验是每加一种试剂，就混匀一下，直到最后一种试剂加完。 

对于初学者，还要区分制胶的玻璃板是 1.0cm 还是 1.5cm 的，两者需要的制胶液体量是不一样的。另外，玻璃板一定要洗干净，本人平时都是用洗洁精洗干净然后用水冲洗最后用纯水冲洗，再放在烤箱里烤干并晾至室温。 

2.点样：

点样的过程很简单，表手抖就 OK 了。再者，点样的过程一定迅速，不然前面的样容易弥散，虽说不至于太影响结果，但对于有强迫症的同学来说还是比较致命的伤害。 

3.跑胶：

注意，跑胶时也会出现各种乌龙，如果跑了好大一会儿还不见条带下移，请看一下你的玻璃板是否放反；如果跑胶时发现温度过高，可检查一下正负极是否连接反了。跑胶建议恒压，80V 30min， 120V 60min（这个得具体看目的条带的 位置，时间可相应增减） 

4.转膜：

请牢记转膜顺序（黑色面-滤纸-海绵-胶-膜-海绵-滤纸-白色面），如若搞不清楚，可想象一下，蛋白质是带负电荷的，应该是往正极方面跑，所以膜应该放在正极面。转膜时要恒流， 285mA—300mA 60min。特别注意的是跑胶时恒压，转膜时恒流这个条件。 

5.封闭特异性抗原：

封闭和孵育抗体也是非常关键的步骤，封闭建议大家用 5%的脱脂奶粉， 2 个小时（或者过夜），不建议用 BSA。 

6.一抗孵育：

封闭完以后不用洗直接孵育一抗，一抗配置溶液是 3% BSA 的 TBST（注意封闭和抗体孵育用的蛋白，封闭用牛奶，抗体孵育用 BSA，这个条件是决定条带是否齐整及有无杂带的关键），过夜（或 2 个小时）。时间上与封闭错开，如若封闭过夜，则一抗只需要两个小时。 

7.二抗孵育：

洗三遍后孵育二抗 1 小时，洗的时间很重要，习惯是洗三遍，第一二三次分别是 5min、10min、15min。还要特别强调的是，孵育和洗膜用的转速是不一样的。孵育是低速，使膜和抗体有充分的接触时间；洗膜时要用高速，以使膜洗得干净。还有，一抗孵育时正面朝下，封闭和二抗孵育时都是朝上。（表问为什么，不知道，经验之谈） 

8.曝光：

当满足了所有以上的实验条件之后，你就可以自信满满地去曝光了。相信我，不管是磷酸化的还是普通的蛋白，都会出现平整光滑的条带。

最后说一下配置实验所需的各种溶液：TBST 可以买，也可以自己配置；同时 TBST 可以用 PBST 代替，即 PBS 加吐温就可以了。封闭和抗体孵育时所用的 5%的脱脂奶粉和 3%的 BSA 都是用 TBST 配置。洗膜时用 TBST 和 PBST，这个就不用说了吧。