干货分享：动物过继法去除支原体步骤

细胞长着长着然后越来越慢，然后随便你加什么它就在那里，不增不长，甚至还翻个白眼给你看，可能是支原体感染了 怎么办？

可以试试动物过继法（可动物成瘤细胞的福音）:

1.取3只4-5周龄BALB/c裸鼠，每只于右侧腋下皮下接种可成瘤的细胞，待肿瘤平均体积长至约1.0 X 1.0X 1.0cm3时，得到荷瘤小鼠。将荷瘤小鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%(体积百分比浓度)的乙醇水溶液中3-5 min，得到消毒后的小鼠；在超净工作台内，用无菌剪刀和无菌镊子从消毒后的小鼠胸口剪开小鼠皮肤，小心剥离得到肿瘤组织。

用眼科剪稍微剪碎肿瘤组织(此时的肿瘤组织大小为0.5 X 0.5 X 0.5cm3)，

2.加0.01mol/L PBS中浸泡(使肿瘤组织*浸润在0.01mol/L PBS中)2min后将其取出，得到浸泡后的肿瘤组织。用眼科剪在无菌平皿上充分剪碎浸泡后的肿瘤组织(此时的肿瘤组织大小为0.2X0.2X0.2mm3)，在剪碎浸泡后的肿瘤组织的过程中适时滴加0.0 Imo I /L PBS,保持该肿瘤组织处于湿润状态，得到剪碎的肿瘤组织。向盛有剪碎的肿瘤组织的无菌平皿中滴加胶原酶I溶液，用I mL枪头吹散肿瘤组织(为了能更好的吹散细胞，建议把枪头剪掉3mm），得到胶原酶肿瘤组织混合物。

3.把胶原酶肿瘤组织混合物转移到50mL离心管中，将盛有胶原酶1-肿瘤组织混合物的50mL离心管在震荡器上进行震荡3 min，得到震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物，将震荡后的胶原酶-肿瘤组织混合物在37°C水浴锅中孵育2 min，得到胶原酶消化后的肿瘤组织，然后离心洗涤

离心洗涤操作步鄹如下：

将孵育后的胶原酶消化后的肿瘤组织于300g下离心6 min，弃上清液,加入20 mL 0.01mol/L PBS,混勾后于300g下离心6 min，再弃上清液

再加入20 mL 0.01mol/L PBS，混勾后于300g下离心6 min，弃上清液，反复三次得到胶原酶消化后的肿瘤组织。

加入该细胞的*培养基，在细胞培养箱中培养两天，细胞培养箱中CO2的体积百分比为6-8%，温度为35-38°C，得到组织结构松散的肿瘤组织，再在结构松散的肿瘤组织中加入胶原酶溶液进行消化。重复之前的离心操作步骤，

向组织结构松散的肿瘤组织中加入胰酶溶液，得到胰酶-肿瘤组织混合物，将胰酶-肿瘤组织混合物在在超净工作台上常温静置1-3分钟后，加入双倍的胎牛血清FBS终止消化，倒掉胰酶肿瘤组织悬液，得到胰酶消化后贴壁的肿瘤单细胞。

加入细胞*培养基置于培养箱培养，传代后送STR检测,支原体检测，此操作可以去除大部分细胞的支原体污染并且可以提升细胞的活力。

友情提示，不足1000个字的操作方法看起来简单，但是操作起来可能需要1-2个月的时间哦，另外原代肿瘤细胞的分离，此步骤也可参考。