怎么预防支原体——看米高梅科学家怎么说（上）

这篇文章Kaustubh Kishor Jadhav撰写的，今天先分享的是他的上一段，关于细胞支原体污染的原因和怎么检测细胞支原体污染，他是米高梅生物科学与技术研究所的研究助理。

如果你正在阅读这篇文章，如果你的实验室里有支原体，不要惊讶。因为它们存在于大多数细胞培养设施、组织培养实验室中，是每个细胞培养工作者必须解决的问题。据估计，高达60%的细胞培养污染是支原体污染（Uphoff，2002年统计）。

支原体被认为是最是简单、最小的细菌之一。缺乏坚硬的细胞壁使它们对抗生素和抗菌药物如青霉素和链霉素产生耐药性。支原体可以通过过滤器，因为它能够变成任何形状以黏附在细胞壁上。

支原体污染的原因

支原体通过各种难以追踪的来源进入细胞培养。这些包括实验室人员、血清、细胞培养基、水浴、培养箱等。人类支原体污染是上述污染的最大来源。污染物可以通过脏衣服、实验服、以及层流气流附近的会语、头皮屑、打喷嚏、咳嗽等传播。此外，无论在哪里保存细胞培养物，持续不断的个体流动都会增加污染的风险。

由于实验室的设备落后以及节约成本等原因，支原体可以通过交叉污染从这些来源传播，这包括对多个细胞系重复使用移液管，而不是使用一次性移液管或重复使用手套。血清也是支原体污染的来源。由于其浑浊的性质，污染是很难检测到的血清，这是较为常用的每种细胞培养。重复使用同一瓶血清可促进支原体的生长。血清营养丰富，也是支原体增殖的最佳来源。另外，它是在高压灭菌后添加到培养基中的，因此，不能保证血清无污染。

在层流气流仓中工作时（说话或移液时）产生的气溶胶也是造成污染的主要原因之一。在传代培养过程中，这些产生的气溶胶将进入培养基，如果细胞系暴露时间较长，这些气溶胶将从空气中进入细胞。这些气溶胶肉眼看不见，因此在导致污染之前无法被检测到。

问题的另一个来源是用于传代培养的培养基，它有液体和粉末两种形式。由于处理不当或实验室环境不好，支原体可以通过这种粉状培养基传播。过滤不能确保*灭菌，因为支原体甚至可以逃逸0.2微米的过滤器。

支原体可以在干燥状态下保持较长时间。当它们接触到营养源时，很快就会开始增殖。一旦它们出现在实验室环境中，就很难*。你可以抑制支原体的生长，但不能**它。当支原体出现在培养基中时，丢弃培养源是一个很好的选择（除非培养源不可替代或价格昂贵）。

怎么检测细胞支原体

用肉眼或光学显微镜检测支原体是非常困难的，那么你怎么知道它在那里呢？您可以使用PCR的检测、DNA染色、荧光标记、琼脂平板等。明智地选择下面列出的任何一种技术，并始终使用第二次分析来确定。在检测支原体之前，细胞应连续培养至少两周，以便有时间让低浓度的污染物生长。对于试验，取样前至少两天或三天不应更换培养基（Uphoff和Drexler，2011）。

软琼脂培养被认为是检测支原体的“金标准"。在这种方法中，细胞培养的上清液被加入液体或半固体培养基（含有支原体生长所必需的营养素）。受感染的细胞在含有培养基的琼脂平板上都会生长。支原体菌落在琼脂平板上很容易看到。除少数支原体外，该方法能检测大多数支原体。

另一种用于支原体检测的方法是PCR。在这项技术中，针对各种常见感染支原体的16sRNA基因的PCR引物被使用。广泛的引物包含几乎所有可感染的支原体。过程中使用的引物要么是物种/基因特异性的，要么是通用的。该方法快速、高效、可靠且效益高（Sung，2006）。

显色法检测细胞支原体。一旦检测到支原体，试剂就会引发一系列的化学反应，从而引起明显的颜色变化。该方法灵敏度高，特异性低（Degeling，2012）。

生物发光检测试剂盒可从不同的生物技术公司获得，这些公司是基于酶的支原体检测试剂盒。这些试剂盒检测的支原体酶不是由真核细胞合成。首先，试剂盒的成分使支原体破裂，然后使用特定的酶来触发产生发光的细胞机制，然后通过光度计检测到。

感染培养基中可加入非特异性DNA染色剂检测支原体。当在荧光显微镜下观察时，支原体DNA除了细胞DNA外，还以小簇的形式出现。

荧光DNA染色是另一种DNA染色方法。这种方法使用像DAPI和hoechst33258这样的DNA染色剂来染色所有的DNA。在这个过程中需要一些专业知识，因为结果解释可能很困难。支原体的低密度、其他细菌的污染或这些细菌产生的细胞外荧光信号都会妨碍正确的结果解释。此外，来自核区的信号使支原体的检测变得困难（Ligasová，2019）。这种方法一般不建议使用。