细胞培养之“麻烦精”支原体的防治方法

支原体是细胞培养中常见的污染，。因支原体属于直径介于0.2-2µm的最小原核生物，形态易变，所以即使用滤网给培养基过滤20次，它还会在已经感染的培养基中“阴魂不散"，而又因为它缺少细胞壁，没有这层外衣包裹之后的它，可以成功逃过大部分抗生素的“追杀"。在细胞培养液中，支原体可达到107-108CFU/mL（CFU=Colony Forming Unit，是一种支原体的浓度测量单位）而不使培养液混浊及影响细胞生长，而因为在初感染时它不会给细胞带来任何影响，这一点，估计黑胶虫都要被它隐蔽得方式折服。

那么支原体污染对细胞有什么影响呢？

1.支原体污染导致细胞收缩，贴壁细胞脱落裂解，细胞空泡化。。。

2.引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA 的合成障碍；

3.使培养基成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢

4.破坏细胞膜的完整性，影响细胞信号传递；

5.引起细胞的染色体异常；

6.使恶性细胞致癌能力下降、影响淋巴细胞分化以及细胞中病毒的产量。

支原体污染有哪些检测方法？

1.相差显微镜检测；

2.低张处理地衣红染色观察；

3.DNA荧光染色法；

4.电镜检测；

5.3-H胸腺嘧啶掺入法；

6.聚合酶链反映法；

7.免疫学方法；

8.支原体的培养。

支原体污染的补救的方法：

1.抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24-48小时，再换入常规培养液，有时可能有效。推荐用量：庆大霉素 200ug/ml ,四环素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。对于支原体污染抗生素应用，预防性应用比污染后使用好。

2 . 加温除菌：根据支原体耐热性能差的特点。将受支原体污染的细胞置于41度中作用5-10小时可以杀灭支原体。但由于41度对培养细胞本身也有较大的影响，故处理前，应*行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的处理时间。

3.裸鼠过继法：将支原体污染的细胞用0,25%胰酶,0.02%EDTA消化制成单细胞悬液后用PBS洗涤离心2次,调细胞密度至10^7 /ml;经小鼠背部皮下接种0.2ml细胞约10~15天后即可形成移植瘤;3~4周后无菌条件下取出移植瘤组织,剔除坏死部分,用注射器针芯在200目筛下将组织压碎使细胞释放入含0.1%EDTA的无血清DMEM培养液中:将细胞悬液小心加入含有淋巴细胞分离液离心管上层,室温下水平离心 3000r/min,20min;用吸管吸出两种液体界面层的细胞，置无血清DMEM培养液中,再用无血清DMEM将细胞洗涤离心1次,用*培养液调细胞密度至5×105个/ml,置37℃,5%CO2培养箱中培养。