细胞培养无小事——细胞培养的主要步骤

 一个小细胞可能会把人弄得吃不下，睡不着，焦头烂额？？？信不信还真的有这样的事情 ，可能整个实验下来计划是三个月左右，但实际有时候出手的第一步就遇到了拦路虎，why？细胞总是养不好；天啊，马上就到了三个月了，SO sad，下面我们就来看看细胞主要的培养步骤吧。

选对培养基很重要：

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，一般首先选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首先选的培养基。 

GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？

GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎*降解。

酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。

培养基中丙酮酸钠的作用是什么？

丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。 

一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。 

大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。这个特别在血清上体现的很明显，有些血清沉淀特别多，客服都会告诉您这个是血清的析出蛋白，让您不要离心直接使用也是这个原理 ，因为离心之后您的血清连那么点营养蛋白都没有啦 

38 在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定 

同时细胞的状态也非常重要，有些老师认为，肿瘤细胞反正可以无限传代，那么我就用之前传过188代的细胞来做实验又如何，要是细胞的形态好，可能真的没有什么问题，但是若细胞形态也不行，那要考虑是否用这个细胞了 ，一般细胞的形态不好涉及到三个方面：1.培养基使用的不对严重改变细胞的营养环境，细胞为自救不得不变异以求生长；2.操作手法不对，造成细胞污染等，3.传代次数太多，因为每次传代都会给细胞造成轻微的损伤，导致细胞在传代之后不断的修复，修复的细胞需要的衍生物，比如血清，培养基，可能会根据配方和批次的不同，给细胞造成不同程度的变异。

So easy的操作手法：

第一见细胞的时候，都不知道从何入手，太娇贵了 ，怎么办？其实，我们只要记住一点就可以了：无菌操作，无菌操作，无菌操作，重要的事情说三遍，之后我们就可以放开手脚，大干一场了。 

Step 1 ： 冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后，须立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。注意：复苏不一定要离心，除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可。

如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。 

Step 2:怎么培养？

培养关键点还在传代操作，一想到传代，天啊 ，会不会很复杂？首先我们要等到细胞到达80%-85%的密度再进行操作，为什么是这个密度？因为这个密度刚好是细胞生长的鼎盛期，因为细胞和细胞间都会有信号通路互相联系，这个时候他们都共同商量好了要努力生长，然后传代之后，他们看到空间还是这么大，就会把努力生长的精神一直传承下去，直到他们过了生长鼎盛期到生长平顶期为止。当然有些贪婪的聚集成簇生长的细胞，他们会不辞辛苦，日以继日的生长，直到培养基不能给他们提供一点养分为止。 

Step 3:不可忽略的重要的传代过程：

1.37度水浴加热*培养基，0.25% 胰蛋白酶/EDTA溶液，我们不建议在37度温度下加热试剂和培养基，水浴优先使用。

2. 用DPBS冲洗细胞，并倒掉洗过的DPBS。

3. 加入1 ml 0.25% T/E溶液装入T-25瓶中。轻轻摇动烧瓶，以确保T/E溶液*覆盖细胞。用显微镜观察细胞形态的变化。

4.。在孵育期间，准备一个15毫升的锥形离心管与5ml胰酶中止液

5.在消化时，轻轻敲打培养瓶的侧面，将细胞从表面剥离出来。在显微镜下检查，确保所有的细胞间隙变大并且都开始呈流沙状脱落。

6.. 向培养瓶中加入5 ml胰酶中止液，将分离的细胞转移到15ml离心管中。用另外5 mll胰酶中止液清洗培养瓶以收集残留的细胞。

7.将15毫升离心管以1000 rpm离心5分钟，收集消化好的细胞沉淀。

8.将细胞沉淀分别滴入我们要分瓶的容器里，完成传代。