实验分享：血脑屏障实验的操作步骤

从19世纪末，保罗·埃尔利希在一个实验中发现了这个屏障，后期科学家跟进研究后发现血脑屏障（BBB）对机体发挥着重要作用。BBB结构和功能的完整对于维持神经元功能，使中枢神经系统免受病原体、炎性因子、损伤的影响有重要意义。缺血性脑血管病的发生、发展与BBB结构和功能的破坏密切相关。

一． 实验试剂准备：

1. 准备好无钙镁离子PBS磷酸盐缓冲液，cell systems人脑微血管内皮细胞（货号：ACBRI 376)建议使用无钙镁离子的缓冲液实验.

2. 通过稀释 0.5 mg/mL 纤维素溶液和 0.3 mg/mL 胶原蛋白 IV 溶液，在 1.5 mL 微管中分别使用 1x PBS 至 100 mg/μL 等分，制备 10 μg/mL 胶原蛋白 IV 和 10 μg/mL 纤维素溶液。此后，将两种等分的100μL与1，800μL的1x PBS混合在2 mL微管中，并将其储存在-20°C。也可使用cell systems原代细胞专用包被液（货号：4Z0-201），铺板后静等2分钟，吸掉包被基质，直接铺板细胞，节约时间，简单方便。

3. 预备好培养基，cell systems原代细胞经典培养基(货号：4Z0-500)包含包被液和生长因子，并且不含抗生素。

4. 准备胰酶，在 50 mL 管中稀释 45 mL 的 1x PBS 的 10x 浓缩胰蛋白酶-EDTA 溶液的 5 mL，制备 1x 胰蛋白酶-EDTA 溶液并将其储存在 4°C，也可以cell systems传代套装（货号：4Z0-800),包含PBS，胰酶，胰酶中和液，一套解决所有消化试剂的准备问题。

5. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤，制备 500 mL LB 介质。加入500 mL的消毒水，并高压灭菌。

6. 在 500 mL 玻璃瓶中称量 10 g LB 肉汤和 7.5 g 的琼脂，准备 LB 琼脂。在高压灭菌前加入500 mL的消毒水，不要关闭烧瓶盖。高压灭菌器，让溶液冷却，直到可以接触。

二.血脑屏障细胞的生长

1. 使用12 孔板，请将细胞包被液种到孔里。

2. 将板和每个刀片解压在生物安全柜中，并在那里执行进一步步骤。使用消毒钳抓住刀片在其宽基上移动它。

3. 用90μL的10微克/mL胶原蛋白IV和10μg/mL纤维蛋白混合物覆盖每个刀片的多孔膜。之后放入细胞培养箱中孵育24小时，在37°C下孵化。

4. 将 1 mL 的 1x PBS 移入每个刀片，然后用真空泵吸出溶液，用于细胞培养，将刀片洗涤两次。

 注意：若使用cell systems细胞包被液，前三的步骤可省略为：使用移液管将包被液移入孔板里，静等2分钟后吸出，无需清洗，直接执行第四步。

5. 通过在上部移液 0.5 mL 的预热 cell systems经典细胞培养基和下腔室的 1.5 mL 来平衡膜。在具有5%CO2大气的细胞培养箱中，在37°C下孵育30分钟

6. 种子2 x 105人类微血管内皮细胞进入每个上腔，并在细胞培养箱中以37°C孵育12孔板。

7. 使用真空泵从细胞培养液中吸出培养基，然后通过移液 10 mL 的 1x PBS 清洗单层，然后用真空泵对溶液进行吸气。

8. 将5ml的培养基吸出培养瓶，用1x浓缩胰蛋白酶-EDTA*覆盖细胞。在细胞培养箱中37°C下孵育烧瓶3-5分钟。注：如果细胞未分离，请轻拍培养瓶让细胞脱落。

9. 加含有血清的培养基中和

10. .在 210 x g下将悬浮液离心 3 分钟，用真空泵去除上清液，用移液器将细胞重新悬浮在 5 mL 的培养基。

11.  将细胞悬浮液的10μL与10μL的0.4%台盼染色剂混合在1.5 mL微管中，使用细胞计数器。将10μL的混合物加入计数室滑块，放入细胞计数器，然后开始计数。

12. .将计数器聚焦在单元格上，使其边缘为深蓝色和中间白色。之后，启动适当的细胞计数程序。

13.要计算每个刀片的体积，请将每刀片获得的 2 x 10^5个单元格的细胞悬浮液的计算浓度分开。

三. 血脑屏障模型的培养

在37°C下孵育12孔板14天。

上腔室的培养基每天更换 0.5 mL，下腔培养基每 2-3 天更换 1.5 mL。在更换培养基之前，请先预热。真空泵吸气，避免产生气泡注意：小心工作，避免接触膜。

通过显微镜成像细胞，检查细胞的状态，并确定汇合。确保14天后汇合度为100%。

四. 细菌的制备

1. 测量前一天，将大肠杆菌菌株的菌群复苏在LB培养基里。在37°C下孵育培养24小时，在孵育摇床中孵育180rpM

2. 在 4°C 的 LB 琼脂板上培养大肠杆菌菌株。取一个带消毒的采摘管，并将采摘放入具有 3 mL LB 琼脂培养基制备的培养管中。

3. 为每个刀片准备一个 LB 琼脂板，并填充培养皿，将其总体积减半。让他们变成固体，并存储在4°C。

五.  细胞的药物实验

1. 播种后的第14天，用化合物处理细胞或测量转皮电阻（TEER），。

2. 要是由感兴趣的化合物处理细胞，将该化合物稀释到调整好浓度稀释到*培养基中。将0.5 mL的混合物加入上腔室，将1.5 mL添加到下腔。再次进行培养。之后，通过真空泵吸气和移液进行正常的细胞换液处理。

六. 渗透性测量

1. 为了获得恒定的细菌浓度，用波长为600纳米的光度计测量光密度。用LB培养基在50 mL falcon管中将过夜的细菌溶液稀释至OD600为0.5±0.05。在冰上工作。

2. 向比色皿中加入1毫升LB培养基。启动光度计，将比色杯放入，标记侧朝前。按下底部“空白"，然后测量空白值。

3. 将细菌溶液注入比色杯中，放入比色杯中，然后按压底部样品，测量细菌溶液的密度。在稀释过程中重复测量，直到获得最终浓度。

4. 在生物安全柜中工作，可使用准备好的12孔板和OD600=0.5的细菌溶液处理细菌。仅向每个含有0.5 mL培养基的上腔中添加450µL细菌溶液。

5. 在37°C的培养箱中培养12孔板6小时。

6. 用移液管从每个下腔取50µL培养基样品，方法是用镊子取下插入物。注意不要将培养基从上腔溅到下腔。

7. 将每个样品置于单独的琼脂平板上。将样品滴在平板上，用细胞撒布器划出溶液。

8. 在37°C的培养箱中培养琼脂平板24小时。

9.计算每个平板中的菌落数

CELL SYSTEMS血脑屏障部分参考文献：

1."Cysteinyl leukotriene receptor type 1 antagonist montelukast protects against injury of blood–brain barrier" Zhou et al. Inflammopharmacology, 2019

2."Alterations of the Endocannabinoid System in Post-ischemic Endothelial Cells of the Blood Brain Barrier" Thurston (Dissertation) 2019

3.Exosome-Mediated Transfer of ACE2 (Angiotensin-Converting Enzyme ） from Endothelial Progenitor Cells Promotes Survival and Function of Endothelial Cell" Wang et al. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2020

4."RAGE and CCR7 mediate the transmigration of Zika-infected monocytes through the blood-brain barrier" Costa de Carvalho et al. Immunobiology, 2019

5."Binding Heterogeneity of Plasmodium falciparum to Engineered 3D Brain Microvessels Is Mediated by EPCR and ICAM-1" Bernabeu et al. mBio, 2019

6."In Vitro Cell Models of the Human Blood-Brain Barrier: Demonstrating the Beneficial Influence of Shear Stress on Brain Microvascular Endothelial Cell Phenotype" Rochfort and Cummins et al. Blood-Brain Barrier, 2018

7."Modulation of glucocorticoid receptor in human epileptic endothelial cells impacts drug biotransformation in an in vitro blood–brain barrier model" Ghosh et al. Epilepsia, 2018.