复苏细胞的注意事项

到了复苏细胞开始实验的环节了 ，以下是整理的一些复苏细胞的注意事项：

1. 细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。只要一直在液氮，冻存没有问题，那么复苏也不会出现很大的问题，不存在有效期限，细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，复苏一定越快越好，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

2. 取细胞时应做好防护措施，带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

3. 必须在1-2min内使冻存液*融化，复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。如果冻存管的壁较厚，隔热效果较好，可以适当提高水浴温度（37℃~40℃）。冻存液建议选用进口产品，DMSO含量为5%,并添加海藻糖和丙二醇以及细胞生长因子，细胞成活更高.

4. 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。复苏后若需要长时间（>1h）等待，建议往离心管加15ml以上培养基摇匀以稀释DMSO给细胞带来的毒性作用。对于不离心直接加入培养基培养的细胞，培养基的加入量是个需要考虑的问题。主要涉及DMSO的浓度，一般DMSO含量为5%的细胞，在7.5ml的*培养基里不受影响，细胞可正常生长（这招很管用哦）。

5. 关于细胞溶解后，是否需要离心的问题，需要根据特定的细胞情况而定。主要有两种方式。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液（后贴壁后即换液）。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是须离心后，将冻存液倒干净，且一定要倒干净。悬浮细胞和贴壁比较慢的细胞一定要离心，比如NCI-H716,和LNCAP等特殊培养方式的细胞。

6. 有些细胞复苏后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要换液，耐心等待，两周后再做决定。不要复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。MLO-Y4就有这种毛病，技术复苏后各种花式优待它就是不长，然后大家都不想理它了，放了一周多拿出来，竟然长满了。