实时荧光定量PCR的优化（四）

这期我们来学习设计TaqMan探针，应该考虑的因素有以下这些......

1、TaqMan探针的最佳长度在20bp，不超过30bp，这样才能实现荧光淬灭。有些情况下超过30bp也是可以的，需要将淬灭基团设计在距离5'端18～25bp的地方。

2、TaqMan探针的Tm值要比引物的高10°C，通常在65～70°C之间，确保探针比引物先结合在模板上。

3、探针序列应该避免连续的单碱基重复序列，尤其是G，因为这可能影响探针的二级结构，降低杂交效率。

只能使用这种单碱基重复序列时，可通过肌苷替代鸟嘌呤，中断连续。

如果是5'端有太多鸟嘌呤，也会产生不好影响，淬灭探针的荧光。

4、TaqMan探针的GC含量应该在50%。

5、探针5'端应该尽可能与3'端相似，保证Taq酶快速降解探针。

6、制备好的探针应采用HPLC纯化