细胞转染实验技术——功能实验的第一步

转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源核酸片段（DNA或RNA）而获得新的表型的过程。转染后的细胞会产生重组蛋白，或者特异性的增强/抑制细胞中的基因表达。转染后的检测主要包括基因水平和蛋白水平的检测。一定时间后收集转染处理后的细胞，采用超声或酶解的方法破碎细胞，离心得到上清。针对基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 进行验证，蛋白水平，使用 western blot 检测，简单，快速，准确。

转染的类型

根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬转和稳转。根据转染方式可以分为化学方法，生物方法，物理方法。

瞬时转染是指将构建好的质粒或者siRNA通过某种方式导入到哺乳动物细胞内（常用的工具细胞 HEK293 细胞），该外源核酸片段不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂，外源基因会逐渐丢失，在细胞内能够存在 3-4 天，无法随着细胞的分裂进入到子代细胞中。在这一段时间内，外源基因在细胞内发生转录翻译，得到少量的蛋白。根据使用的载体不同，收集目的基因/蛋白进行检测的时间不同，通常在转染后48h，目的蛋白的表达水平最高。瞬时转染的特点是短时间内进行蛋白的小量制备，满足后续的实验要求。

稳定转染是外源DNA整合到细胞基因组中，成为细胞基因组的一部分从而得以复制，随着细胞分裂，子代细胞也同样表达外源基因，这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的，先对细胞进行转染，再对得到的细胞池进行筛选，筛选标记是抗生素，荧光报告基团等，通常需要2-3周的筛选时间，由此形成稳定转染的细胞系。稳定转染的特点是能够得到蛋白的大量、长期生产，满足后续的一系列体内体外的表型实验。

转染方式

考虑到转染效率是影响细胞实验的重要因素，因此选择合适的转染试剂和转染方式很关键。下面我们介绍一下常见的转染方式。

细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，对于也带负电荷的核酸片段（DNA和RNA）来说是不可透过的屏障，因此研究人员开发了很多方法能使核酸穿透细胞膜进入胞内，大致分为三类：

细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，对于也带负电荷的核酸片段（DNA和RNA）来说是不可透过的屏障，因此研究人员开发了很多方法能使核酸穿透细胞膜进入胞内，大致分为三类：

转染的影响因素：

转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞类型；细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；转染试剂等。转染实验中，以下几个因素进行调整和优化：

1. 转染前的细胞状态和密度

转染时细胞密度以 50-80%最佳，细胞密度过高会严重影响细胞状态和转染效率（周期进程阻滞，凋亡增加等）。同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率，因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。

2. 转染时的质粒纯度

如果提取的质粒不纯，如带少量盐离子，蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成；而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用（一般用去内毒素的提取试剂盒）。抗生素一般对真核细胞无毒，但转染过程中细胞通透性增加，会使抗生素进入细胞，从而降低细胞活性，导致转染效率降低。

3. 转染后的筛选时间

转染后筛选不能太早或太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大，增殖较慢，太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。一般要在转染后48h之后开始加抗生素筛选。

4. DNA 与转染试剂的比例

许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。不同细胞系转染效率通常不同，不同转染试剂转染效率差别很大，通常需要根据转染试剂说明书进行预实验，选择合适浓度的外源DNA或RNA，调整外源核酸片段和转染试剂的比例。