非基因组DNA的提取

一、DNA提取方法简介

2、非基因组DNA的提取

2.1、质粒DNA的提取

2.1.1、碱裂解法

l 碱裂解法原理

染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；

当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；

变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。

l 碱裂解法流程图

l SDS碱裂解法提取质粒DNA中溶液1的成分及作用

溶液Ⅰ  50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0 葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去

溶液Ⅱ   0.2M NaOH / 1% SDS 破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提

溶液III   3M 醋酸钾 / 2M 醋酸

这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。 

2.1.2、煮沸法

l 煮沸法原理

染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；

当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；

变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。

2.2、线粒体、叶绿体DNA的提取

线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。

l 差速离心法原理

是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。

将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。