表皮角质形成细胞模型构建实验方法

一、材料

无菌

实验前 3 天制备饲养层（见方案 23.4)。照射 3T3 细胞（30 Gy) 和人成纤维细胞（70 Gy)，最好用含较多细胞的悬液
FAD:Wu 等 [1982] 研制的一种用于饲养层培养的高钙培养液，含有 Ham's F12、DMEM 和添加物。Ham F12 和 DMEM 混合培养液（1:3) 添加 1.8Xl0-4mol/L 腺嘌呤、10-10mol/L 霍乱毒素、1～10ng/L EGF、0.4ug/ml 氢化可的（木公）、5%～10% FCS、100U/ml 青霉素和 50ug/ml 链霉素

角质形成细胞生长培养液（keratinocytegrowth medium，KGM ): 基于 Boyce 和 Ham [1983] 研制的 MCDB153 培养液的无血清培养液（见表 10.1 和附录Ⅱ)，添加低钙（0.03～0.5 mmol/L ) 牛垂体提取物。可加入 CaCl2，以升高钙离子浓度
角 质形成细胞限定培养液（keratinocyte-definedmedium，KDM ) : 基于 Boyce 和 Ham 于 1983 年研制的 MCDB153 培养液的无血清培养液（见附录 1)，是化学成分限定性培养液，Stark 等 [1999] 曾在器官型培养试用过

SKDM(supplemented KDM )：
(a) 不含垂体提取物的 KDM (Promocell、Clonetics)；
(b) 添加 5ug /ml 胰岛素、0.5ug/ml 氢化可的（木公）、0.1ng /ml rhEGF 、20ug/ml
转铁蛋白、0.1% 髙纯度血清白蛋白（无内毒素和脂肪酸，如 A-8806,Sigma) 和 50ug/ml 抗坏血酸；
(c) 调整钙离子浓度至 1.3 mmol/L ;
(d ) 原代角质形成细胞可用未包被的塑料培养皿在 SKDM 中培养，然而细胞增殖活性较低。将角质形成细胞接种在涂有 I 型胶原蛋白的培养皿上时，生长情况可得到改善。

在含有成纤维细胞的胶原凝胶上作器官培养时，SKDM 对表皮生长和分化的作用与 FAD 的作用无区别

D-PBSA

0.5% EDTA(约 15 mmol/L )

分析级甘油
添加 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 培养液

酶：
(a) 热解素（T -7902,Sigma)；
(b)0.2% 和 0.6% 胰蛋白酶（1:250)；
(c)2.4U/mlⅡ型 dispase (Boehringer Mannheim)。

聚维酮碘溶液（10% 碘）

低温保存管

50 ml 离心管

尼龙网

细胞滤器（BectonDickinson)

100 mm 细菌培养级 Petri 培养皿

手术刀和弯镊



二、操作步骤

取材

1. 人皮肤常取自新生儿和幼儿的包皮，也可在手术时或尸检后（死后 48 h 之内）取自躯干皮肤。在贴壁和增殖方面，自新生儿和幼儿的包皮分离的角质形成细胞优于自成人躯干皮肤分离的细胞。

2．将皮肤组织块在聚维酮碘溶液（10% 碘）中孵育 30 min ，以预防感染。聚维酮碘溶液降低角质形成细胞的活力不明显。

3．用 D-PBSA 浸洗 10 min,2 次。

分离表皮最好分离全厚皮肤

4．用 Castroviejo 取皮刀（Storz Instrument) 切取全厚皮肤，厚度为 0.1～0.2 mm 。可用弯剪除去皮下组织和部分真皮。

5. 用手术刀将皮肤切成 1 cmX2 cm 小块。

6. 用 D-PBSA 浸洗组织块 2～5 次。

7. 通过下列其中之一步骤用蛋白酶孵育组织块。
(a) 胰蛋白酶：在 37℃ 条件下，将皮肤组织块放入含有 0.6% 胰蛋白酶的 D-PBSA (pH 7.4) 中，漂浮 20～30 min。此步骤也对全厚皮肤消化很有效。
(b) 冷胰蛋白酶在 4℃ 条件下，将组织块放人预冷的 0.2 % 胰蛋白酶中，漂浮 15～24 h 。需用酚红显示胰蛋白酶液的 pH, 以免 pH 变化引起酶活性和细胞活力的改变。
(c) II 型 dispase: 在 37℃ 条件下，用 2.4U/ml dispase 畔育 30 min 。
(d ) 热解素：在 4℃ 条件下，用 0.5 mg/ml 热解素孵育 12～16 h 。

8. 仔细观察表皮的分离情况。当在皮肤组织块边缘见到表皮开始分离时，将组 织块放人 100 mm 塑料 Petri 培养皿内，真皮侧朝下。然后，加入 5 ml 含有血清的*培养液。

9. 用两把细弯镊剥下表皮，然后将表皮收集入含有 20 ml *培养液的 50 ml 离心管。
(a) 用胰蛋白酶分离时，通过用吸管轻轻吹打和用孔径为 100um 的尼龙网 (细胞滤器，B-DBiosciences) 过滤即可从表皮分离出有活力的角质形成细胞。 .
(b) 从经 dispase 或热解素消化分离的表皮获取细胞时，需在 37℃ 条件下将表皮用胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液（浓度分别为 0.2% 和 0.05%) 孵育消化 10 min。

10. 用胰蛋白酶分离皮肤后，从真皮轻轻刮取附着不牢固的表皮细胞，然后将刮取的细胞加入表皮细胞悬液。如果角质形成细胞的纯度不太重要，这一方法能够获得较多的表皮细胞。但是，角质形成细胞培养中有很多间质细胞污染。

11．通过离心（100 g，10 min) 将分离的表皮细胞用培养液洗 2 次。计数细胞总数和不吸收台盼蓝的活细胞数（见方案 21.1)。

原代培养

12. 调整细胞密度。在 37℃ 条件下，用 FAD 或 KGM 接种细胞。
(a) 3 天前将有丝分裂后的 3T3 细胞 [Rheinwald and Green，1975](见方案 14.3) 或皮肤成纤维细胞 [Limat et al，1989] 接种于培养皿。以 2X104～5X104 个/cm2 密度将角质形成细胞接种在饲养细胞上，用 FAD 培养。
(b) 如不用成纤维细胞培养，在 FAD 以高密度（1X105 ～5X105 个/cm2) 接种原代角质形成细胞，并在传代培养时保持高细胞密度。
(c) 在含有低浓度钙离子（0.03～0.1 mmol/L 的 KGM 中，以低密度 (1X103 个/cm2) 或高密度（5X104 个/cm2) 接种细胞。用同样的培养液作传代培养。
(d) 在 SKDM 中，细胞贴壁和生长较慢，故最好将 SKDM 用于需要增殖活性低的实验。

13. 1～3d 后，细胞贴壁。细胞贴壁后，用培养液充分浸洗细胞，除去未贴壁的死细胞和已分化的细胞。然后/加人 FAD 或 KGM ，继续培养：可通过调整 KGM 的钙离子浓度促进角化和减慢生长。

传代培养

14. 传代培养方法如下。
(a) 用 FAD 培养
    (i) 用 1.3～2.7 mmol/L (0.05% 0.1%) EDTA 液孵育细胞 5～15 min ，使细胞去附着。此时，可见细胞间隙变大。
   (ii) 在 37℃ 条件下用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L(0.05%) EDTA 液孵育细胞 5～10 min，然后用吸管轻轻吹打，使细胞充分去附着。
(b) 用 KGM 培养
   (i) 由于 KGM 的钙离子浓度较低，不需要用 EDTA 预处理。
  (ii) 如用 FAD 培养方法，用 0.1% 胰蛋白酶和 1.3 mmol/L EDTA 液孵育细胞。

低温保存

15. 为了保存大量自同种组织分离得到的细胞，常需进行低温保存。取汇合前的原代培养细胞时，低温保存效果好。
(a) 按前述的方法用胰蛋白酶消化细胞，离心（100 g，10 min)。
(b) 用含有血清的*培养液混悬细胞，计数。
(c) 用含有 20% FCS 和 10 % 甘油的 FAD 将细胞密度调整至 2X106 个/ml，
然后将细胞分装人冻存管。
(d) 在 4℃ 条件下将冻存管放置 1～2 h。
(e) 用程控冷冻仪（Planer) 按 1℃/ min 的冷却速度冷冻细胞。也可将冻存
管插人充满异丙醇的细胞冷冻盒（如 1℃ 冷冻容器，商品号 5100-0001，NalgeNunc) 中。这样，将细胞冷冻盒放入-80℃ 冷冻箱时，使冷却速度适当。
(d) 细胞复苏：
   (i) 将冻存管在 37℃ 水浴中快速融化。
   (ii) 用培养液将细胞稀释 10 倍。
   (iii) 将细胞离心后，用所需培养液将细胞混悬至合适密度。然后，将细胞接种于培养皿。