背根神经节细胞的原代培养实验步骤

获得消毒动物后详细的步骤如下：

1．无菌条件下仰卧放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，断头后打开胸腹腔，除去内脏器官。从颈部椎管开口插入显微剪，沿脊柱背侧中线两侧剪开椎管，去除暴露脊髓后，即在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节，用精细显微摄小心提取，并剥除其被膜。

2.若施行组织块培养，可用精细显微剪将每个背根节剖为2-3个植块，直接接种于涂有鼠尾胶的基质上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。

3.如若需要背根神经节分散细胞培养，则可将分离好的DRG组织块收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清终止消化后，900r/min离心5min,去除上清。而后依照总论的方法在含10%胎牛血清的DMEM培养液中制成单细胞悬液，调整细胞浓度为(0.5-1)X105/ml接种细胞于多聚赖氨酸包被的介质上，37℃,5%CO2的孵育箱内培养。

4.以上两种培养方法24h后均倾去培养皿内种植培养液，改用无血清培养液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培养。接种第3天，加入细胞分裂抑制剂ARA-C以抑制非神经细胞的增殖，作用48h后半量更换新鲜培养液，以后每周1/2量换液2次。

5.纯化培养的DRGs可以存活2个月之久，纯度可达96%以上。分散培养的DRG神经元48h可见胞体有光晕感，圆形或椭圆形，大小不一，有多极、双极和假单极神经元。2d后给予抑制剂处理后，DRG突起生长迅速，形成稀疏网络状结构。随着培养时间的延长，神经元突起的主干和分枝明显延长并增粗，神经突起网络变得更加致密，杂质细胞已经脱壁漂浮，培养物背景变得干净清晰很多，免疫细胞化学进一步鉴定培养细胞为神经丝(NF)阳性（图1-3)。