分离培养细胞的操作步骤

一、材料

无菌 

1. 转运培养液：Ham F12（Seromed 08101），不含 NaHCO3，含有 20 mmol/LHEPES(Serva 25245),75 ml

2. 生长培养液: Ham F12, 添加 20%FBS（Gibco 011-06290），200 ml 

3. 链霉菌蛋白酶液：0.15% 链霉菌蛋白酶（Sigma P-6911）、0.03% EDTA（Merck 8418）、20IU/ml 青霉素和 20ug/ml 链霉素（0.4%Eurobio PES300），用 Ham F12 或 D-PBSA 配制 100 ml 

4. D-PBSA：100 ml

5. 尼龙网：孔径为 100um

6. 手术刀 

7. 锋利的长剪刀 

8. Petri 培养皿：直径为 90 mm，用于切组织块 

9. 培养皿：25 cm2，4 个 

10. 20 ml 离心管或一般容器，5 只 

非灭菌 

1. 血细胞计数板 

二、操作步骤：

1. 分离：用手术刀切除活检组织块上的非肌性组织，然后用 D-PBSA 浸洗。

2. 称重前，与肌纤维平行将切除活检组织切成片，用 D-PBSA 冲洗。

3. 将组织片平行放入 Petri 培养皿盖内，切成较薄的柱状组织块，然后切成 1 mm3小块。不要挤压组织。也可在试管内用长剪刀将组织简称小块，应避免挤压组织。

4. 用 D-PBSA 浸洗组织块，静置后吸取上清液。

5. 在 37℃ 条件下，用链霉菌蛋白酶液消化组织块 1 h。每 1~3 mg 组织块用 15 ml 链霉菌蛋白酶液。每间隔 10~15 min 轻轻摇晃试管。

6. 孵育后用吸管研磨组织块。由于越来越多的细胞分离下来，培养液会逐渐变得浑浊。

7. 让组织块沉到试管的底部，形成沉降的组织块（P1）和上清液（S1）。

8. 用孔径为 100um 的尼龙网将 S1 滤入 20 ml 离心管。轻轻摇晃或用吸管吹打上清液，使细胞混悬。

9. 离心（350 g，8~10 min）后，吸取上清液。

10. 准确加入 10 ml 生长培养液，用带有橡皮吸头的吸管很轻微地混悬细胞。然后，用血细胞计数板计数细胞。

11. 用生长培养液稀释细胞悬液，以约 1.5x104个/ml 的细胞密度将细胞接种于培养瓶。从 1 g 健康供体活检组织约获得 1~2x105 个细胞。

12. 将 15 ml 消化液加入 P1，在 37℃ 水浴中孵育组织块 30 min，并定时摇晃。

13. 用吸管吹打细胞悬液，使细胞分散。然后，用尼龙网过滤细胞悬液。用 20 ml 生长培养液浸洗滤网。

14. 离心（350 g，8~10 min）后，计数细胞，按上述方法接种细胞。

15. 将培养瓶移入湿润的培养箱，在 37℃ 和 5%CO2 的条件下培养细胞，

安全提示
在扔入垃圾前，应该用次氯酸盐处理剩余组织和使用过的试管、吸管、培养皿。

维持培养 

16. 接种后 24 h 很轻微地换培养液，以后每 3~4d 换液 1 次。细胞主要向着分化生长。人成肌细胞的生长分 3 期，培养后 4~6d 增殖达高峰；8d 作用排列成 行；10~12d 细胞融合形成肌管增多。然而，必须记住一些细胞可能分化较早，绝大多数细胞分化时一些细胞仍处于增殖状态。

传代培养 

17. 将少量 EDTA 轻轻注在细胞上面后立即吸取。

18. 加入 0.25% 胰蛋白酶液，足以在细胞上面形成一薄层。

19. 当细胞去附着时，加入 5~10 ml *生长培养液，用吸管很轻微地吹打细胞，然后离心（350 g，10 min）。

20. 计数细胞，按一定密度种植细胞。