大鼠肝星状细胞原代培养实验——胰酶消化法

一、实验材料准备

1.  动物：雄性SD大鼠(体重250-450 g)。
 

2.   试剂：戊巴（匕匕）妥钠，小牛血清(或胎牛血清，则更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚红 0.02 g/L)，HBSS，台盼兰等。
 

3.  器械：手术器械，200目尼龙网，相差显微镜，荧光显微镜。
 

二、原代培养方法
 

1.  大鼠腹腔麻醉后在超净台上剖腹，进行门静脉插管，以D-Hanks'液灌注，同时剪开下腔静脉，冲掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型胶原酶)。

2.  待肝脏变软后，离体肝脏并剪碎，继续以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型胶原酶)消化15 min，尼龙网过滤后以450 g 离心5 min(4℃，下同)。

3.  以HBSS重悬沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于离心管中，并分别覆以2-3 ml HBSS，1450 g离心16 min后取界面细胞。

4.  以HBSS重悬后再次离心收集细胞，以DMEM重悬后进行细胞计数，并判断存活率和产量，最后按照常规方法接种(105细胞/cm2)，次日换液，以后每2-3天换液一次。
 

三、传代方法

弃去培液后以D-Hanks'液洗两次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，镜下观察细胞突起回缩(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)终止反应(若不用EDTA，可以不需离心)，充分吹打后以1:2-1:3接种，然后继续培养(5%CO2，37℃)。
 

四、 结果

接种次日，光镜下可见细胞呈星芒状，胞质内有脂滴，荧光镜下328 nm处见自发荧光。附上发表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(图1)。