大鼠脑微血管内皮细胞原代培养实验——酶消化法

一、实验材料准备
 

1.  实验动物
 

每次实验采用10只2-3周龄SD大鼠，雌雄均可，体重40~60 g。

2.  试剂
 

纤连蛋白(fibronectin)、Ⅳ型胶原、鼠尾胶、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)购自Sigma公司；D-Hanks'液、10xPBS按配方自制；II型胶原酶购自Worthington公司；明胶、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES购自Amresco公司；Percoll 购自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)购自GIBCO/BRL公司；肝素钠、NaHCO3购自中国医药集团上海化学试剂公司；青、链霉素购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)购自PAA Laboratories；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，胶原酶/分散酶(collagenase/dispase)购自Roche公司。
 

3.   仪器
 

低温离心机(Centrifuge 5810 R，购自Eppendorf；Himac CR 22F，购自Hitachi)。
 

4.  试剂配制
 

（1）1 mg/ml鼠尾胶(用0.2%乙酸配制)，1%明胶(用D-Hanks'液配制)，1%II型胶原酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%的浓度)，1%胶原酶/分散酶(用DMEM配制，用时稀释成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，调pH值至7.4后用0.45 um滤膜过滤除菌，较难过滤)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/ul)，以上试剂经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装保存于-20℃。

（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10xPBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培养液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素钠 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 ug/ml)，pH值调至7.4，过滤除菌后分装保存于4 ℃，用时加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
 

二、培养皿预处理
 

1.  涂布3种不同的基质，培养前一天加入1 ml 1%明胶于35 mm塑料培养皿，置于37 ℃培养箱过夜，接种前用D-Hanks'液漂洗2次。

2.  接种前4 h，加入鼠尾胶6~10 ug/cm2，在密闭的器皿里用氨气熏5~10 min后，置于室温1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。

3.  50 ul 0.1%纤连蛋白、50 ul 1 mg/ml Ⅳ 型胶原和400 ul双蒸水混合后，加入到每个培养皿中涂布均匀后吸出，可涂布10个培养皿，置于37 ℃培养箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
 

三、 脑微血管段的分离与脑微血管内皮细胞原代培养
 

1.  大鼠颈椎脱臼处死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后断头置于玻璃培养皿中，打开颅腔后取出全脑置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培养皿中解剖去除小脑、间脑(包括海马)。

2.  随后将大脑半球在干滤纸上缓慢滚动以吸除软脑膜及脑膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培养皿中，用细解剖镊去除大脑白质、残余大血管和软脑膜，保留大脑皮质。

3.  用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培养液，用虹膜剪将其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型胶原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大脑)混匀后37 ℃水浴消化1.5 h。

4.  离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入20% BSA悬浮混匀后离心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖悬浮混匀后离心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上层神经组织及大血管，保留底部沉淀。

5.  加入2 ml 0.1%胶原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)悬浮混匀后37 ℃水浴消化1 h，离心(1 000 rpm，8 min，室温)，去上清液，加入2 ml DMEM培养液悬浮后铺于经离心形成连续梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。

6.  离心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的红细胞层之上的白黄色的层面即为纯化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗两次(离心1 000 rpm，5 min，室温)，去上清液。

7.  加入DMEM*培养液(含20% FBS，100 μg/ml肝素钠)悬浮后接种于涂布基质的35 mm一次性塑料培养皿(1.5 ml/培养皿，可接种1个培养皿/大脑)，置于37 ℃、5%CO2培养箱内静置培养，12~24 h后换液，并加入1 ng/ml bFGF，随后隔天换液。

 

四、鉴定方法
 

形态学、Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测。
 

五、 结果
 

1.   细胞形态观察
 

接种当时可见由圆形的内皮细胞构成的呈单枝状或分枝状的脑微血管段，并可见散在的单细胞及组织碎片(见图1-1)；培养12~24 h后可见培养的细胞从贴壁的微血管段周围长出，细胞呈短梭形，区域性单层生长，经换液后微血管段的残余部分不断减少，成纤维细胞、周细胞等杂细胞含量较少；随着培养时间的延长，内皮细胞不断增殖，可见"漩涡"分布，大约5~7天细胞达到融合，短梭形的内皮细胞占90%以上，但可见少量周细胞等杂细胞生长于内皮细胞单层表面或细胞克隆间隙(结果未显示)。细胞生长过程见图1，细胞接种于纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿。


 

2.   涂布不同基质的细胞生长情况
 

明胶及鼠尾胶涂布的培养皿微血管段贴壁时间较长，6 h时可见少量微血管段贴壁但无内皮细胞长出，12~24 h可见一些内皮细胞长出，24 h后脑微血管段*贴壁并有较多的内皮细胞长出，两者无明显差异(见图2-1~4)；纤连蛋白/Ⅳ型胶原涂布的培养皿培养后6 h即可见微血管段贴壁并有一些内皮细胞长出，12~24 h内基本*贴壁并有较多的内皮细胞长出(见图2-5,6)。


 

3.  免疫组化鉴定
 

Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测可见培养的脑微血管内皮细胞的胞浆及核周有棕黄色着色，胞核呈空泡状结构；对照染色为阴性。