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大鼠乳鼠成骨细胞培养实验——酶消化法
发布时间： 2021-12-05 点击次数： 1157次材料与仪器
SD大鼠
F12 *培养液 胰蛋白酶 Ⅱ型胶原酶 酒精
手术器械 磁力搅拌器步骤
一、实验步骤
1. 拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12 *培基液的培养皿中再洗涤， 将颅骨剪成2～5 mm2 碎片，将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。
2. 然后以0.1% Ⅱ型胶原酶10 ml，在37℃环境中消化 20 分钟，室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞，接种于75 ml 培养瓶中，补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟，将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5% CO2，95%空气，37℃温度下培养，24 小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化 1 遍)。
3. 原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶，弃去培养 液，传代时先以 PBS 冲洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室温下消化3～5 分钟，将胰蛋白酶液弃去，加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用 F12 *培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨细胞进行实验。代数太多，细胞老化或者分化明显。
二、结果
如图所示，成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似，但是不同的是，比成纤维细胞更不容易消化，尤 其是传代次数多，细胞老化的时候，非常难消化，并且不易消化成单个细胞。
图1：成骨细胞
图2：成骨细胞100倍
图3：成骨细胞形成的矿化结节三、鉴定的方法
1. 碱性磷酸酶(ALP)活性检测
2. 骨玻璃样蛋白(BGP)检测
3. 矿化结节检测
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