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大鼠视神经少突胶质细胞培养实验——牛血清培养法
发布时间： 2021-12-06 点击次数： 975次材料与仪器
Wistar大鼠
亚（石西）酸钠 腐胺 转铁蛋白 胰岛素 甲状腺素 黄体酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗体
眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱步骤
一、实验步骤
1. 取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，无菌条件下取出双侧视神经。2. 接种至24孔培养板内经多聚赖氨酸处理的盖玻片上。3. 加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培养基，37℃，50mL/L CO2，100%湿度连续培养3 d 。4. 3 d 后弃废液，改为含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 条件培养液继续培养。5. 每周换液2次。在获得足够的细胞数量后，改用无血清条件培养液继续培养，每2 d 换液一次。
二、形态学观察
每天在倒置显微镜，观察培养细胞的生长过程和形态学变化并拍照。
三、免疫细胞化学鉴定
1. 将含细胞盖玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS冲洗3 次x5 min。
2. 冷丙酮固定10 min。
3. PBS冲洗(3 次x5 min)。
4. 30g·L-1 过氧化氢室温孵育15 min。
5. PBS冲洗3 次x5 min。
6. 滴加正常山羊血清，室温孵育20 min。
7. 滴加1:100 GC抗体，阴性对照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。
8. PBS冲洗3 次x5 min。
9. 滴加 生物素标记羊抗兔IgG，37℃，20 min。
10. PBS冲洗3 次x5 min。
11. 滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液。
12. DAB工作 液显色，自来水终止反应。
13. 脱水，透明，DPX封片保存。
四、结果1. 形态学观察结果
组织块24 h 开始贴壁，48～72 h 可见神经组织边缘游出少量细胞，主要为圆形或梭形(图 1)。8～9 d 左右，细胞基本铺满培养孔。此时改用无血清条件培养基培养进行纯化。培养过程中，部分细胞死亡。12 d 左右获得的细胞胞体基本为呈圆形或多角型，直径约 6～10μm。细胞核较大，胞质少(图 2)。
2. 免疫组织化学染色结果
培养的视神经少突胶质细胞的免疫组织化学染色 GC 蛋白阳性，未加一抗的呈阴性。染色结果显示成熟的少突胶质细胞突起丰富，互相形成蜘蛛网状(图 3)。苏木素复染，异质细胞较少，90%以上为阳性细胞(图 4)。
Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10x10)图 1. 培养第 3 天，细胞自视神经迁出 (10x10)
Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10x40)图 2. 培养第 15 天，纯化的视神经少突胶质细胞(10x40)
Figure 3 Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10x20)图 3. 培养第 7 天，少突胶质细胞 GC 阳性表达 (10x20)
Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10x20)图 4. 培养第 15 天，纯化的少突胶质细胞 GC 阳性表达(苏木素复染)(10x20)- 下一篇：大鼠胰岛细胞培养实验
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