如何做好细胞的培养、传代、冻存和复苏？

1.准备工作：

根据培养细胞的特性，提前准备好适合的培养基和血清等。最好沿用细胞原来的培养条件，以免细胞在新环境下还需要过渡适应。同时，充分了解到细胞的生长特性和形态特征，便于后续的培养观察。

2.贴壁细胞传代：

1）移弃使用过的细胞培养液。（不要直接倒掉，避免瓶口残留导致易污染）

2）使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞。从与贴壁细胞层相对的容器一侧轻轻加入冲洗液，以避免搅动细胞层，前后摇晃容器数次，最后移弃冲洗液。（洗去残留的血清，避免影响胰酶的活性。）

3）以 25 cm2的培养瓶为例，向瓶内加入1ml胰蛋白酶-EDTA（请根据各细胞的指引使用合适的浓度）消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，放到37 ℃ 孵育。通常，几分钟内，会发现胞质回缩、细胞间隙增大，倾斜培养瓶时细胞层能自然流下，此时应加入2-3ml含血清的*培养液终止消化（细胞解离所需时间请参考各细胞的指引，并建议每隔30秒在显微镜下观察细胞的解离情况）。另外，并不是所有贴壁细胞都适用采用胰蛋白酶进行解离，请根据各细胞的指引选择合适的解离方法。

4）使培养瓶倾斜，吸取培养瓶内液体轻轻冲向原细胞生长表面，重复该动作2-3次，使所有细胞沿瓶底流下，再轻柔地把细胞吹打成单个悬液（吹打过程中应避免气泡的产生）。

PS：对于难消化的细胞，尽量不要通过用力吹打的方式来处理，以免对细胞产生物理损伤。可以先将已经消化的细胞分出来，及时终止消化。然后再对仍然贴壁的细胞进行再次消化。做到分层消化，避免易消化细胞长时间在胰酶消化下受损。

5）把所有的细胞悬液转移到15ml离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟后移弃上清。

6）加入新的含血清*培养液重悬成单细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

7）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的贴壁情况。

3.悬浮细胞传代：

因悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不必采用酶消化方法，而可直接传代或离心收集细胞后传代。

1）直接传代时，静置5-10分钟，待悬浮细胞慢慢沉淀到器皿底部后，吸掉1/2-2/3原培养液，补足新鲜的含血清*培养液，混匀成细胞悬液。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，轻轻摇晃混匀。

2）离心传代时，将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清后，加入新鲜的含血清*培养液重悬。按各细胞指引推荐的传代比例，把细胞悬液均匀分到各培养器皿中，补足新鲜的含血清*培养液，轻轻摇晃混匀。

3）放到37 ℃ 孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

4.贴壁悬浮混合型细胞传代：

先将悬浮的细胞收集，再参考“贴壁细胞传代"方法进行消化收集，一起接种到培养器皿中。

PS: 悬浮细胞生长中一般对细胞密度要求比较高，培养中最好参考指南控制好细胞密度，不能过密也不能过稀。

5.细胞冻存：

1）按照“细胞传代步骤"中的方法收集细胞。

2）加入细胞冻存液（一般10%DMSO+对应细胞的*培养液），使细胞的终密度为(5~10)×105个/ml，移入细胞冻存管中。

3）程序降温（以使用需异丙醇的Nalgene程序降温盒为例）：4℃ 30min→-80℃过夜→液氮。（一定不能省略4℃的30min，否则冻存液无法渗透到细胞，易产生冰晶导致细胞受损。）

6.细胞复苏：

1）取出贮存的细胞，待液氮挥发后，马上37℃水浴中轻轻摇动使快速融化（通常2min内，时间长了细胞状态会受影响）。为避免剧烈的温差变化导致冻存管炸裂，操作该步时请配戴防护面罩或防护目镜。

PS：干冰运输的冻存细胞，收到后需要立刻放入深低温冰箱或液氮中，至少3d后再进行复苏操作。

2）转移到无菌操作台，75%酒精擦拭冻存管外部。

3）将细胞悬液转移到装有10-20ml经预热的含血清*培养液离心管中，800-1000rpm离心3-5分钟，移弃上清。

4）重新加入经预热的含血清*培养液重悬细胞，以约(3~5)×105个/ml密度接种到培养器皿中。

5）放到37℃孵育，第二天显微镜下观察细胞的情况。

以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎关注安培生物科技有限公司了解更多技术与产品资讯。

安培生物科技有限公司介绍：

安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户，提供*细胞体内可代谢的核酸转染试剂；inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产，包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等，为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务；提供以植物生物为平台基因序列全人源化、*的细胞培养可分解3D基质胶产品；提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务，努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。