如何运用生物化学方法检测细胞凋亡？

本期小编带来细胞凋亡的生物化学检测方法。

一、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法

原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA的片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 

因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。这里推荐ZETA LIFE的Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，实验操作中效果相当不错。

检测方法：1.按照既定程序诱导细胞凋亡；2.按照说明书配制所需溶液；3.常规制备单细胞悬液，用冷PBS洗两次后，取约5×106个细胞，1500rpm离心，弃上清，将细胞悬浮在400 µl×结合溶液中；4.将细胞悬液分成5管，每管约1×106个细胞，阴性对照管不加任何试剂，阳性对照管加2%多聚甲醛固定30分钟，用FITC标记Annexin V和PI双染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC标记Annexin V，最后一管加10 µl PI和FITC标记Annexin V混合，室温孵育15分钟；5.每管各加400 µl 1× 结合缓冲液上机检测。

注意事项：A.确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间；B.由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的胰酶消化贴壁细胞。细胞经过胰酶消化后可能导致胰酶对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议在用胰蛋白酶处理前单独收集培养液中悬浮的细胞，保存在2%的BSA中。

二、磷脂酰丝氨酸单抗（PS）检测法

原理：与Annexin V相比，PS的抗体可以直接用来检测细胞凋亡过程中PS的外翻，而且灵敏度高，特异性强，信号持续时间久，费用更低。

三、TUNEL法

原理：TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名为末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

不足之处：

(1)坏死细胞亦有DNA裂点形成,也可呈现TUNEL反应阳性，因而特异性较差。据报道，TUNEL反应中坏死细胞的标记量比凋亡细胞的标记量少一个数量级。

(2)TUNEL结合免疫组化检测时，固定过程对检测的影响较大，切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果，从而产生结果的差异。

四、ISOL检测法

原理：与TUNEL凋亡检测法类似，ISOL（In Situ Oligo Ligation，原位寡核苷酸片段连接）也是通过末端标记断裂DNA的方法。但该方法的创新在于利用ISOL方法，在DNA的片段的平端或3’端单个突出碱基进行连接扩增，鉴于只有发生凋亡的细胞才会发生平端或3’端单个碱基突出，所以ApopTag 过氧化物酶ISOL凋亡检测试剂盒能够明确的区分凋亡细胞和坏死细胞。

优势：原位特异标记，能够最大限度的降低背景，克服TUNEL法检测的假阳性，适用于石蜡包埋的组织、冰冻组织、贴壁细胞以及悬浮细胞的凋亡检测。

五、DNA凝胶电泳(DNAladder) 

凋亡过程中DNA裂解是标志细胞最终走向死亡的不可逆的重要过程，DNA凝胶电泳也曾被认为是细胞凋亡判定的金标准之一。抽提细胞的DNA,确定样品中DNA的量和纯度，然后在琼脂糖凝胶上电泳。正常活细胞的DNA凝胶电泳为一条区带;细胞凋亡时，由于DNA被裂解成单个核小体和寡聚核小体，电泳时呈现特征性的“阶梯状"(ladder)条带，坏死细胞的DNA是被随机破坏的，不能形成阶梯状条带，电泳时出现类似血涂片的连续性改变。此方法是判断细胞有无凋亡发生的一种简便方法，比较适用于体外培养的非增殖性细胞的检测。

缺点：

(1)特异性较差，特征性的180～200bpDNA梯带的出现并非凋亡所有，另外在某些罕见的情况下细胞发生凋亡可无DNA断裂；

(2)不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位或细胞分化等凋亡信息；

(3)不能进行准确定量，只能进行半定量；

(4)灵敏性较差，要求所测标本细胞数在1×106以上才能使电泳清晰；

(5)适用于只含有单一细胞成分标本的测定，对组织细胞组成复杂者，不能确定凋亡发生于哪类细胞。

六、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定

ELISA是定量检测细胞凋亡的免疫化学法，其基本原理是利用夹心ELISA方法检测细胞凋亡后形成的由组蛋白及DNA的片断组成的核小体。在微定量板上吸附抗组蛋白抗体，加入细胞裂解后离心所得的含有核小体的上清液，核小体上的组蛋白与包被的抗组蛋白抗体结合；加入辣根过氧化物酶标记的抗DNA抗体，与核小体上的DNA结合；加酶的底物，测光吸收值。此方法敏感性高，所需细胞数少，可检测低至5×102/mL的凋亡细胞。此外，此方法不需特殊仪器，比较适合基层工作。

缺点：

(1)不能精确测定凋亡发生的绝对量；

(2)适合单一成分细胞的检测，对于多细胞成分的组织或细胞混合物，不能判定凋亡发生在哪种细胞；

(3)不能提供单个细胞或相关细胞的组织学定位。