变性聚丙烯酰胺凝胶的制备实验

步骤

材料

缓冲液和溶液

参照附录 1 配制贮存液、缓冲液、试剂。稀释贮存液到适当的浓度。

丙烯酰胺溶液（45%m/V）
丙烯酰胺（DNA 测序级）                          434 g
N,N'-亚甲双丙烯酰胺                                  16 g
加水                                                            至 600 ml

加热至 37°C 以促进溶解用蒸馏水调至 1 升，用硝酸纤维素膜过滤（孔径 0.45ptn). 室温贮存于棕色瓶中。另外一种较为昂贵的方法是购买预先混合好的丙烯酰胺: 双丙烯酰胺粉末，再用水溶解。便宜的丙烯酰胺: 双丙烯酰胺粉末通常混合有金属离子。由此配置的贮存液需要纯化，方法是，与 0.2体积的树脂（MB-1,Mallinckrodt) 混合搅拌，再用 Whatmenl 号纸过滤。贮存中，丙烯酰胺: 双丙烯酰胺会缓慢的变成酸性，这个脱氮基过程由光和碱催化。保持溶液 pH 值在7.0 或者以下，在黑色瓶中保存于室温应该每几周重配一次。

过硫酸铵水溶液（1.6%m/V)

去离子水

去污剂

乙醇

KOH/甲醇溶液
在 100ml 甲醇中加入 5 gK0 H 配成，用于清洗玻璃板，贮存在密闭的玻璃瓶中。

聚硅氧烷溶液
传统的聚硅氧烷溶液中包括二氯二甲基硅，它有毒性、挥发性并且易燃。近年来，出现了一些无毒的替代物，包括 Gel Slick(FMC Bioproducts)、RainX(Unelko，Scottsdale Arizona), 和 Acrylease(Stratagene)。

10XTBE 电泳缓冲液
TBE 在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的浓度是 lx(89 mmol/L Tris-硼酸，2 mmol/L EDTA)，这一浓度是琼脂糖电泳用量的 2 倍（请见第 5 章）。用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的垂直电泳槽的缓冲液池一般较小，故所通过的电流量通常相当大。要用 lxTBE 才能够保证适当的缓冲容量。缓冲液的 pH 值应接近8.3。一般无须调 pH 值；可是，对于每次新配的 10XTBE 电泳缓冲液都要认真检査 pH 值。
使用同样的 10xTBE 电泳缓冲液配制胶和工作缓冲液，因为两者之间微小的差异也会导致 DNA迁移时严重扭曲。
使用氨基乙磺酸（36 g/L 的 10XTTE 缓冲液） 取代标准 TBE 溶液中的硼酸可以减少由于形成甘油-硼酸阴离子脂类化合物而导致的在胶的顶部的条带扭曲<Pisa-Willanson and Fuller1992)。若需要更多的信息请参见 DNA 测序反应中的甘油一节。

TEMED(N,N，N',N'-四甲基乙二胺）
电泳级的 TEMED 在很多公司有售（Sigma,Bio-Rad),TEMED 容易吸潮，必须 4°C 贮存在密闭的瓶中。它是聚合反应中的连接催化剂。

尿素，固体

特殊装置

弹簧夹：5 cm 长，每块胶 5 到 7 个。

干胶架
虽然不重要，干胶架对于干燥和贮存测序用的玻璃平板是非常方便的（Bio Whitraker)。

封胶带
例如 3M Scotch Stretchable Tape(Lab Safety Supply,Janesville，Wisconsin)，3M Scotch yellow electrical tape#56(Life Technologies),3M Scotch polytetrafluorethylene(PFTE)extruded film tape。关于不同种胶带的用法和其他封胶的方法，参见 Hengen(1996)。

胶板（配对的） 和隔板
制胶的板一块比另一块略长 3.5-4.0 cm, 或者有一块板是缺刻的。为避免胶板裂了或者漏了，最好保持板是配对的并且和测序胶的槽相对应。

手套
无滑石粉、易处理的橡胶或者聚氯乙烯（PVC)。

凡士林
可选择，见步骤 4

保护性的工作合纸
一面是塑料的（Kaydry Lab Cover from Fisher) 或者 Benchkote。

鲨鱼齿梳子
0.4 mm 厚,32,64 或 96 齿. 依赖电泳装置的能力。

有臂的烧瓶（250 ml)

隔板（厚度一致或者边缘较窄）
每胶两板，由有弹性的薄塑料板（0.4 mm) 或特氟隆（Sanger and Coulson 1978） 制成，使玻璃板隔开。在胶板和隔板之间形成不透水的封口，使未凝固的胶溶液不会漏出。
边缘窄的隔板用于制造底部比顶部厚的胶，使底部的条带比较窄并且整块胶的条带比较均匀。虽然它有这样的优点，但是比较难以制备和干燥。

注射器（60cc)
可选择，见步骤 15.

试管架

55°C 水浴

方法

重要：为防止皮肤油脂的污染. 必须一直带无滑石粉的手套，并且只能拿板的边沿。

准备胶板

1. 必要时，甩 KOH/甲醇清洗板上的旧污渍。

2. 然后用温的去污剂溶液洗涤玻璃板和间隔片，用自来水*冲洗，再用去离于水洗净。用乙醇冲洗玻璃板去掉水印，并放于一旁晾干。
必须小心翼翼地洗净玻璃板. 以确保灌胶时不会产生气泡。

3. 小块玻璃板的内面用聚硅氧烷溶液处理。在化学通风橱内将玻璃板放在一叠纸巾上, 内表面向上，在上面倾倒少量硅烷化液。用几张 Kimwipes 纸在玻璃板表面将硅烷化液涂布均匀，让玻璃板风干（l~2 min）。然后用去离子水洗，再用乙醇洗，风干。

4. 把大块玻璃板（干净面朝上）放在空的试管架上，把隔片放在玻璃板的两边（见图12-9)。
如果用边沿窄的隔片，把厚的一边放在板的底部。在大板和隔片之间加入小滴凡士林使隔片在下一步时不会移动。

5. 再将较小（或带凹口）的玻璃板在间隔片上放置妥当，对齐隔片。

6. 用若干个大弹簧夹（长 5 cm) 将玻璃板的一边夹起来。
在玻璃板另一边及玻璃板底部贴上凝胶密封带，形成不透水密封，必须特别注意玻璃板的底角，因为这是最容易发生渗漏的地方。

7. 将弹簧夹换到已封好的一边，在玻璃板的另一边贴上凝胶密封带。

8. 将梳子放在胶模的敞开端并检査是杏贴切适合，取出梳子将空胶模放在实验桌上。



配胶

9. 在实验桌的工作区上铺上衬塑料的保护纸。
灌制测序凝胶时几乎不可能避免将丙烯酰胺溶液滴于桌面。

10. 在一个 250 ml 有臂锥形瓶中配制适当浓度的丙烯酰胺溶液（表 12-19)。这些溶液足够配制一块 40 cmx40 cm 的测序凝胶。
注意：凝胶的配制必须一气呵成，中间不能断断续续。

11. 混合所有试剂，在 55°C 水浴中加热 3 min 帮助尿素溶解。
溶解尿素的过程十分缓慢，必须依靠外部的热量。大约的体积是 66 ml, 加水到 100 ml。

12. 从水浴中取出溶液，冷却 15 min 至室温。不断搅拌混合物。

13. 把烧瓶放在真空装置里抽去气体。
防止聚合时产生气泡。

14. 把溶液放入 250 ml 玻璃烧杯中。加 3.3 ml 新制的 16% 的过硫酸铵，混匀。
旧的硫酸铵没有足够的聚合能力，会产生模糊的条带。



15. 加 50ulTEMED，轻轻旋动容器以混匀溶液。直接配胶。或者用 60cc 注射器吸取上述溶液约 40 ml。注意，不要有气泡。
与蛋白电泳相比，已经使用了最大量的 TEMED，确保了聚合足够快和足够均匀。聚合速度与时间有关, 温度越低聚合越慢。有经验的人利甩预冷却的方法可以用一次配制的混合物制成多块 40 cmx40 cm 胶。
从此步开始，动作尽可能迅速。

16. 用手托住胶模使之与水平面大约成 45°角，沿一边从移液管中缓缓灌入溶液（参见图 12-9)。



17. 将模子放在试管架上（见图 12-9)。
这一位置减少了模子底部的水压，防止漏胶。

18. 立即将鲨鱼齿梳子的平整侧插入凝胶液约 0.5 cm 处，梳子两端插人液面的深度应当等同，以便使凝胶垂直放置时梳子的平整表面能够保持水平。
如果梳子旁边可见气泡，慢慢取出梳于。洗净梳子表面，重新插入胶中。

19. 用弹簧夹夹住梳子使之就位。将剩余的丙烯酰胺-尿素溶液沿凝胶顶部加入，形成一串丙烯酰胺液滴。让凝胶在室温下聚合 15 min。

20. 冲洗 60cc 注射器以免被聚合的丙烯酰胺所堵塞。
警告：冲洗时将释放出少量未聚合的丙烯酰胺，应戴手套。

21. 聚合 15 min 后对凝胶进行检査，观察是否恰恰在梳子平整表面之下出现一道折射率不同的 Schlieren 线，这道线是聚合理想的标志。聚合完毕后（大约 1 小时），取下弹簧夹。
警告：冲洗时将释放出少量未聚合的丙烯酰胺，应戴手套。

22. 聚合完毕后，凝胶可立即使用（见方案 11)，或保存于室温达 24 小时，或保存于4°C 48 小时。为防止保存期间发生脱水，可将梳子留于凝胶内并在凝胶顶部围放一些用 1XTBE 湿润的纸巾，纸巾可用 Saran 包装膜覆盖。在这一阶段不要拔掉梳子。