细胞传代培养实验常见问题详解

收到细胞先不开盖,用酒精将整个细胞瓶外壁进行消毒，放在培养箱静置若干小时后(看细胞密度而定)在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照(建议收细胞时的培养基拍一张照片，观察培养基的颜色和是否有漏液情况，显微镜下拍细胞100X，200X各两张)，排除细胞本身污染的情况。

视细胞生长密度而定，常规细胞2-3天更换培养基。

一般情况下细胞生长至*汇合后就应该传代，所有细胞生长都有一个要求不宜生长过密(也就是常说的长老了)，但有接触抑制的细胞，在汇合前就必须进行传代，这类细胞一般在密度70-80%就进行传代，否则会引起细胞分化。

去掉原T25培养瓶里面的培养基，T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;弃PBS，再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化细胞，显微镜下观察，待细胞变圆，细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁，加4 ml左右*培养液混匀终止消化，将细胞小心吹打下来，1000 rpm/min室温离心5min;弃上清，细胞沉淀用*培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:2-1:3，1:3-1:6，1:6-1:8)，每T25瓶补足培养基至5-6 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，将细胞悬液移入离心管中，1000 rpm/min 室温离心5 min。弃上清，细胞沉淀用*培养液重悬，按要求分瓶(视细胞密度而定1:4-1:8)，每T25瓶加*培养液至4-5 ml，37℃、5%CO2孵箱培养。有些悬浮细胞趋于成团生长，此时细胞生长状态良好，当补液时，需避免反复吹打。

一般使用trypsin-EDTA浓度为0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液浓度过高时，易造成培养基中细胞碎片增多，黑渣子增多，常规细胞传代时建议用0.05%的胰酶进行消化，对于难消化的细胞可采用0.25%胰酶进行消化，细胞密度过高超过80%时，采用分步消化法。胰酶储存在–20°C，解冻在4°C进行，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20°C，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，并可减少污染之机会。

胰酶消化的程度是细胞培养中的一个关键步骤：消化过度细胞碎片增多，黑渣子增多，细胞会成片脱落，严重影响细胞活性，并有部分细胞漂浮，随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下，反复吹打同样也会损伤细胞活性。

不同细胞对消化液的敏感性不同，胰酶消化的时间也会有差异。胰酶消化时间与胰酶的浓度，是否含EDTA，胰酶的储存时间，胰酶的储存温度，是否反复冻融，消化加入的胰酶体积，消化温度及细胞的密度有关。消化对于新购买的细胞，建议客户先用低浓度的胰酶仔细去摸索一下消化时间，可每隔1分钟镜下观察细胞是否变圆，记录最佳消化时间，下一次操作参考之前的记录来控制时间即可。

细胞传代或冻存时欲回收细胞，其离心速度一般为800-1000 rpm/min，室温离心5-8分钟，转速过高，将造成细胞破裂死亡。

显微镜下观察：活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。也可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000 个/毫升，在0.1 毫升的细胞悬液中加入0.1 毫升的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝10min内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行。

EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，易造成细胞状态不好，最终造成细胞无法存活。

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

细胞传代后放入培养箱没有摇匀，或者放入时摇匀，但在细胞贴壁前，又移动了培养瓶，频繁开关培养箱引起的振动或者培养瓶中培养液过少，培养箱搁板表面不平整，这些因素会导致细胞生长不均匀。

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。运输过程对细胞有严重影响。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。

一些悬浮细胞抱团生长是正常现象，大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。如果出现了细胞团，可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团，也可以尝试一下方法：将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养(该方法只能去除部分较大的细胞团)。

部分细胞本身存在一定的空泡(如HepG2，Ishikawa及一些耐药株等)，这个是正常现象。如果只有少数细胞有内出现极少空泡，则很可能是细胞状态不佳，可以通过调整血清浓度，控制消化，控制传代比例及时间等方法来调整细胞状态;如果大部分细胞出现空泡，且单个细胞内空泡数目偏多，则可能细胞代次较高，细胞老化所致，需更换代次较早的细胞。

很可能是培养体系不适合细胞(未使用推荐的培养体系);或者消化过度，对细胞有严重影响;或者是传代比例不合适(具有密度依赖性的细胞，传代太稀;或者生长较快的细胞，传代较密，细胞严重堆叠生长)。

细胞增殖变慢有以下原因：1. 消化过度 2. 传代过密 3.细胞营养不良 4.细胞频繁传代 5.细胞状态不佳或老化 6.细胞存在污染。

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g时，细胞培养时应使用10% CO2;当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g时，则应使用5% CO2培养细胞。

定期(每周一次)更换水盘里面的水，水盘的水必须使用无菌蒸馏水或无菌去离子，水盘中可添加1%硫酸铜以预防霉菌污染。

依照细胞株基本数据上的接种密度或稀释分盘的比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长的一个重要原因。按照我们的经验：一般倍增时间24 h内的细胞，传代比率1:6-1:12为宜，倍增时间24-48 h的细胞，传代比率1:3-1:8为宜，倍增时间超过48h的细胞, 传代比率1:2-1:4为宜。

首先肉眼观察培养液是否变浑浊，如果变浑浊，基本可以确定是污染;如果肉眼观察培养液没有变浑浊：在显微镜下观察黑点大小和形状是否规则，是否运动，是做布朗运动还是呈直线型快速移动。如果黑点大小不规则，做布朗运动，黑点可能是细胞碎片(可能是细胞状态不佳或者消化过度引起的)，也可能是血清反复冻融产生的蛋白沉淀引起的，也可能是细胞的代谢产物。如果黑点大小一致，快速移动，很可能是细菌污染。

掌握细胞传代的最佳时机，不要细胞长老了再传代;掌握好消化时间，防止消化过度产生细胞碎片;减少血清等试剂的冻融次数;将培养液的PH调到最佳;严格控制水质和器皿的清洁。

如果判定黑点是污染，请及时将细胞处理后丢弃。其他情况，可参照以下进行：

如果是悬浮细胞：收集细胞上清慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶;如果是贴壁细胞：将细胞用PBS洗2-3遍，洗的时候，轻轻拍打培养瓶，让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落，再弃去PBS，消化时先加低浓度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右，让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来，去掉低浓度胰酶，然后正常消化细胞，将收集的细胞悬液慢速离心(500-600 rpm/min，5-6 min)并更换新的培养瓶，并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。

不同厂牌的dish或flask，其所coating的polymer不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish或flask而有显著之生长差异。