-
制备YAC DNA进行Southern印迹分析
发布时间： 2021-12-24 点击次数： 884次材料与仪器
酵母菌
AHC SCE SCEM Tris·Cl EDTA TE 乙酸甲 RNase A 异丙醇 NaCl
培养箱 离心管 转子步骤
1. 接种一个红色的含YAC克隆的酵母菌落于盛有20 ml AHC培养基的250 ml 三角烧瓶中，在旋转摇床上30℃ 250 r/min 振荡培养24 h。2. 扩大培养：取1ml 由步骤1获得的粉红色菌悬液接种于盛有100 ml AHC培养基的 1 000 ml三角烧瓶中，于30℃ 250 r/min摇床培养24 h。
3. 将菌悬液移入2个50 ml 的锥形离心管中，于2 000 g 离心5 min，弃上清，共用5 ml SCE缓冲液重悬菌体，并合并到一个试管中。
4. 加1 ml SCEM缓冲液，在旋转摇床中37℃ 100 r/min 轻摇晃混匀。
5. 于4℃ 2 000 g 离心弃上清，菌体用5 ml Tris/EDTA裂解液重悬。
6. 加0.5 ml 10%SDS颠倒混合数次，于65℃温育20 min。7. 加2 ml 冰浴的5 mol/l pH4.8的乙酸甲缓冲液，颠倒混合数次后置于冰浴60 min。
8. 于室温2 000 g 离心10 min，小心将含核酸的上清转移到一个新管中。加室温2倍体积的95%乙醇，颠倒混匀。
9. 于室温2 000 g 离心5 min，弃上清，在室温晾干10~15 min，分别加入3 ml TE缓冲液，pH8.0于37℃过夜溶解核酸。
10. 加入0.1 ml 的1 mg/ml 无DNA酶活性的RNase A，于37℃温育1 h。11. 加入6 ml 室温的异丙醇，振荡并颠倒混匀后用一支毛细管缠绕起染色体，然后溶于0.5 ml TE缓冲液中。
12. 加入50 μl 5 mol/l NaCl和2 ml 95%乙醇，颠倒混匀。
13. 再一次缠绕起染色体DNA，并溶于0.5 ml TE缓冲液中，于4℃保存备用。14. 取毎小份2 μg 的YAC DNA和15 μg 用以构建YAC文库的某物种或个体的基因组DNA。
15. 采用几种高频切割的限制性内切酶进行酶切，接着用单拷贝探针进行杂交和核酸印迹分析。16. 一旦通过核酸印迹实验确证YAC克隆，那么可通过制备染色体凝胶校块塞和进行脉冲电场凝胶电泳，来明确重组YAC的大小并对其稳定性进行初步评价。同实验其他方法
YAC 克隆的分析实验
1. 用接种棒将含重组载体pYAC的AB1380菌株划线接种在AHC平板上，倒扣平板于30℃培养，直至长出1~3 mm 大小的红色菌落为止。 2. 短期保存：用Parafilm膜将平
以上就是本期的内容，更多资讯，欢迎点击安培生物网站链接了解更多技术与产品资讯。
安培生物科技有限公司介绍：
安培生物坚持为生命科学研究、活体动物转染、大规模生物生产、基因和细胞治疗领域客户，提供*细胞体内可代谢的核酸转染试剂；inviCELL™Platelet lysate无动物血清产品旨在支持广泛的细胞扩增和生产，包括培养间充质干细胞和多种免疫细胞系等，为制药公司或者生物技术公司提供无血清细胞培养规模生产服务；提供以植物生物为平台基因序列全人源化、*的细胞培养可分解3D基质胶产品；提供內毒素≦ 1.0 EU/mL、对细胞无毒性影响、高纯度的一型胶原蛋白产品。安培生物专注为生物医药领域提供优质的产品和技术服务，努力发展为基因治疗、细胞治疗的生物科技企业。
- 下一篇：牙签法小量制备质粒DNA实验
- 上一篇：YAC 克隆的分析实验 实验库 参考来源：
销售热线
