IPS细胞怎么诱导分化？

IPSC生成通常是实现真正的实验目标的中间步骤。

它一般应用于：

人胚胎发育建模；

作为难以分离的细胞来源，用于基础研究和疾病建模；

药物筛选应用；

细胞替代治疗。

IPS神经分化的protocol，以下是神经细胞的分化操作步骤，可供参考：

准备好神经诱导分化的培养基，建议使用Essential 8TM培养基以Matrigel基质胶作为基质，或者使用StemPro hESC SFM培养基以Geltrex作为基质。

1、高品质的PSCs（无分化或者仅含少量分化的克隆）是进行有效的神经诱导的关键。在传代PSCs时去除所有的或者大部分分化的克隆。分化的克隆可以通过使用Nikon显微标志和Nikon显微C-OA 15mm目标适配器被标记

2、当PSCs达到~70-80%融合时，根据PSC分种实验方法将PSC接种到6孔板中在分种PSC团块前，确定分种的密度，方法如下：

3、当准备好PSC细胞悬液后，取部分细胞到15-ml锥形管中来估算PSC细胞悬液的总细胞量（如，将6孔板的一个孔中的细胞制备成6ml PSC细胞悬液，邓1ml来进行细胞数估算）。

4、将装有细胞的15-ml锥形管以200×g离心3分钟，弃上清。

5、加入1ml预热的StemPro Accutase细胞消化液，37度孵育5分钟。

6、用1ml的移液管上下猛烈的吹吸5次，将细胞分散成单个细胞悬液。

7、选择你常用的方法计数总细胞数。如果在1ml Accutase细胞消化液中的总细胞数为1×10^6，那么剩下的5ml PSC细胞悬液中的总细胞数为1×10^6×5=5×10^6

8、加入2.5ml PSC培养基至包被好的6孔板的每个孔中。

9、温和的混匀有PSC细胞悬液的锥形管，将PSCs以2.5×10^6-3×10^5的数量接种到每个孔中。例如，如果PSC悬液为1×10^6个细胞/ml，将0.25-0.3ml PSC悬液加入到每个孔中。

10、快速的前后左右晃动培养皿，将细胞分散到整个表面，于CO2培养箱中培养。

以下点需要注意：

1、分种 的比例根据在分种前PSCs的融合程度用PSC细胞系类型的不同而有所差异。在分种后的第一天即开始进行神经诱导（大约传代后24小时）。在传代PSCs时，PSCs的起始密度应该在15-25%的融合细胞需要以团块状接种，避免成为单个细胞。单个细胞接种PSC易增加细胞的死亡。

2、在分种的时候可以将10um ROCK抑制剂加入到PSC培养基中处理过夜，以防止细胞的死亡。

3、如果起始用的PCS状态很差，非神经样的克隆将会在培养中出现。在这种情况下，可以有两种操作选择：

a、如果仅在培养皿的极少区域出现该细胞形态，在挑除非神经样分化的克隆后可以继续培养。为了去除非神经样分化的克隆，先用显微标记出所有非神经样分化的克隆。倾斜培养皿，用巴氏玻璃吸管将标记的克隆吸掉去除。将培养皿旋转180度，重复以上步骤。操作每个孔时均重复以上步骤，以避免细胞缺少培养基而需经受无培养基压力。

b、如果出现了大量的非神经样的克隆，建议放弃继续培养，而选择高品质的PSCs重头开始。

c、更换培养基一定要注意，请预热*培养基，冰冷的培养基加入会导致细胞皱缩和漂浮。

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