ELISA实验操作注意事项及常见问题解答

一、ELISA操作前准备工作

试剂盒的选择

ELISA操作前，应做好实验的设计、选择适合自己检测范围和灵敏度的试剂盒、提前订购和准备试剂及耗材、处理样本等准备工作。

样本处理

在收集标本前需有一个完整的计划，需要清楚要检测的成份是否足够稳定。ELISA检测提倡新鲜标本尽早检测，对收集后当天就进行检测的标本，及时储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，请取材后，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。因冰室与室温存在一定温差，蛋白极易降解，直接影响实验质量，所以避免反复冻融。

二、ELISA标准品溶解

标准品是试剂盒的检测抗原的一个度量标尺，因此标准品的溶解、倍比稀释和保存要特别注意以下细节：冻干标准品溶解按照说明书的要求，准确复溶。在冰上操作标准品为佳，静止5－10分钟，轻轻摇匀后按照一次量分装，在-20度或-70度保存。标准品严禁反复冻融。标准品的倍比稀释应事先做好准备，如离心管的准备和编号以及稀释液的准备；稀释时，应充分混匀；采用进口或者硅化的EP管，减少蛋白吸附。在实验孔内进行倍比稀释时，注意操作规范，枪头勿刮划预包被的孔底。

三、ELISA操作中的洗涤

洗涤是ELISA实验中是最多次数的操作，也是非常重要的步骤。不严格的洗涤容易出现洗不干净或交叉污染现象，实验重复效果差的现象。不管用多道加样器、洗瓶、吸管，还是洗板机，严格按照说明书操作不要减少步骤洗涤的洗涤体积、洗涤时间和洗涤次数。注意标准化操作将减少实验误差和不同实验之间的误差。操作者常出现洗板不干净现象，请比照“手工洗板小贴士"操作：

a)洗液不要溢出孔外，以免污染相邻的孔，特别是每次洗板的前两遍，若高浓度的孔污染了低浓度的孔或空白孔，其造成的交叉污染的孔是洗不掉的，背景肯定会增高。

b)特别注意：设计实验的时候要考虑实验孔的位置，保证甩掉洗液时，空白孔、低浓度孔或阴性对照组在上面或一侧或分开最好。同时注意甩掉洗液的动作翻转（从正上方旋转120－150度）要迅速、干脆。甩板不要手腕左右摇摆、旋转来甩液体！甩出后以直线方式补2－3次甩出液体。 

c)用干净的滤纸，不要用卫生纸，因为细小粉尘或者碎屑容易吸附到孔底，导致洗板不干净，结果偏高或偏低，重复孔的数值也会相差很大。

d)每次拍板不要重复在一个地方拍，特别是洗去酶的步骤；拍板不宜过轻，否则拍不干净，拍板很用力不会对蛋白有什么影响。但注意不要太重，以至把板条给拍断。每次洗板后轻叩几下，最后一次一定要扣干净。

e)不能减少洗液体积、洗板时间和次数。洗板时间太短，洗板效果不佳。延长洗板时间和增加洗板次数可以使背景更干净。

四、ELISA的标准曲线如何拟合？

一般情况按照说明书推荐方法拟合标准曲线。标准曲线可以由酶标仪附带软件自动生成，也可手动制作。标准曲线呈“S"形曲线，两端趋于水平，中间趋于线性，中间部分为较佳的检测范围。当标准品的量超过与包被抗体结合的量，此时标准品已饱和，再增加标准品的量，其OD值不再变化，故当标准品达到一定浓度后，曲线就趋于水平。一般厂商给出的浓度范围落在中间线性范围，根据标准曲线，可以测出样本的浓度。按照科学分析方法，如果存在“奇异点"或者“污点"，直接采用线性分析不是很好，要对拟合标准曲线的几个点进行取舍，同时也可改用双对数直线拟合或者四因素曲线拟合。

五、常见问题

1、ELISA试验出现非常弱的结果，常见有7种原因，其解决方法如下：

1)可能原因：温育的时间或者温度不够；

解决方法：校正温育箱温度。

2)可能原因：显色反应时间太短；

解决方法：校正定时钟准确定时。

3)可能原因：所用配制缓冲液的蒸馏水有问题；

解决方法：使用新鲜合格的蒸馏水。

4)可能原因：加入抗体/酶的稀释液浓度太低；

解决方法：按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。

5)可能原因：酶标仪滤光片不正确；

解决方法：检查酶标仪使用的滤光片。

6)可能原因：试剂盒没有充分平衡；

解决方法：试剂室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温。

7)可能原因：不正确的试剂储存方式；

解决方法：按照说明书要求保存试剂盒。

2、试验的标准曲线和测定的重复性差，这是什么原因造成的？

答：试验的标准曲线和测定的重复性差，这是典型的由测定操作引起的问题，常见原因如下：

a)可能原因：加样本及试剂量不准；孔间不一致；

解决方法：校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密。

重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近；

重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；

样品稀释前应充分混匀。

b)可能原因：加样过快，孔间发生污染；

解决方法：重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性；加样不要过快。         

c)可能原因：加错样本；

解决方法：检查记录和试剂，是否加错样本。

d)可能原因：加样本及试剂时，加在孔壁上部非包被区；

解决方法：加样枪头不要贴壁。

e)可能原因：不同批号试剂盒中组分混用；

解决方法：不同批号试剂盒中组分不可混用。

f)可能原因：温育时间、洗板、显色时间不一致；

解决方法：检查时间是否一致。

g)可能原因：孔内污染杂物；

解决方法：离心样品，排除杂物。

h)可能原因：试剂/样品没有混匀；

解决方法：充分混匀样品和试剂。

i)可能原因：血清标本未*凝固即加入，反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血    

细胞，易出现假阳性反应等。

解决方法：待血清标本*凝固后做试验。

3、 试验结果白板，而且阳性对照不显色，应如何分析和查找原因？

答：试验结果白板，而且阳性对照不显色，常见原因如下：

a)可能原因：漏加或者误加试剂；

解决方法：检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。

b)可能原因：试剂过期；

解决方法：使用有效期内的产品。

c)可能原因：洗板液配制中出现问题，如量筒不干净含HRP酶抑制物（叠氮钠 

等）；

解决方法：使用干净的器皿，正确配制试剂。

d)可能原因：温育的时间或温度不够；

解决方法：校正温育箱温度。

e)可能原因：标准品失活或者丢失；

解决方法：标准品正确保存、溶解和混匀。

f)可能原因：抗体失活或者丢失；

解决方法：更换抗体或者提高抗体浓度

g)可能原因：酶失活或者丢失

检查方法：把工作浓度的酶再稀释20－100倍，取5uL加入50ul的显色底物，终止后显色是否能达到1.0左右，此为酶的粗略估计。

解决方法：更换酶或者提高酶的浓度。  

h)可能原因：显色底物失活

检查方法：加少量的工作浓度的酶，TMB是否很快显色。

解决办法：更换显色底物.

4. 试验结果空白背景高，这是什么原因造成的？

答：试验结果空白背景高，常见原因如下：

a)可能原因：洗板不干净；

解决方法：充分洗涤，*拍干；洗板要防止交叉污染；浓缩洗液准确配制；吸嘴尽可能一次性使用；加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用，不要反复使用，否则易造成污染。

b)可能原因：显色液变质或者试剂过期；

解决方法：检查试剂盒有效期。

c)可能原因：试剂稀释有误，如加酶的浓度过高；

解决方法：请按说明书所示稀释倍数配制；

d)可能原因：蒸馏水受酶等污染；

解决方法：使用新鲜蒸馏水；

e)可能原因：试剂混用；

解决方法：不同批号试剂勿混用。

f)可能原因：培养箱温度超过37℃或反应时间过长。

解决方法：显色反应时间适当缩短。

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