流式细胞术的空白对照、同型对照、FMO对照要怎么选？

流式数据分析时，应该把门设在哪里合适呢，特别是那些分群不明显的结果。

我们知道流式细胞术常见的有空白对照（未染色细胞）、同型对照和FMO对照，每种对照适用于什么情况呢？

1、空白对照：空白对照的作用是作为电压调节的参考，调整电压参数使细胞信号在图上各个通道的合适位置。同时，也是可以看到细胞的本底信号，圈门时直接排除。

未处理的细胞，不能作为处理组细胞的圈门依据，需要使用相同处理组的空白对照，来观察细胞的本底信号。

空白对照适用于细胞分群明显、背景荧光弱、已有大量研究的分群明确的细胞群圈门，例如CD3、CD4、CD8等等。

2、同型对照（isotype）：同型对照的作用是排除背景荧光，使用同型对照可以更准确地排除假阳性。

例如，以下这张图，黑色线的是空白对照，黄色是同型对照，红色是实验组染色细胞，可以看出同型对照和空白对照会有所差别，会有少量的非特异性染色。

当非特异性染色比较强时，如果继续用空白对照作为圈门依据，实验结果就不能准确反映真实情况了。

一般抗体说明书都会有同型对照和抗体染色的验证图，我们在选择抗体时尽量选择阳性峰与同型对照峰分得比较开的，通常抗体公司也会有此抗体对应的同型对照出售。

3、FMO对照：FMO对照也叫做荧光扣除对照/抗体减一对照（Fluorescence-Minus-One Control），是指在多色染色分析时，对其中某一个通道设置的阴性对照，也就是不染目标通道的颜色，其他指标都染色。多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。

FMO对照有两个作用：

（1）多色分析时，有些通道的信号不好区分，可能存在某个荧光对该通道干扰很大，可以使用FMO对照来找到这个荧光。

（2）作为我们需要重点分析的某个指标的阴性对照，可以排除全染的背景影响，有助于更准确地圈门。

对于一些分群不明显，或表达量不高的指标，使用FMO对照作为圈门依据会比空白对照更合适。

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