SD大鼠骨髓间质干细胞培养方法技巧

SD大鼠骨髓间充质干细胞简单介绍：

       骨髓原始间充质干细胞(SD大鼠骨髓间充质干细胞)是骨髓基质干细胞，是人们在哺乳动物的骨髓基质中发现的一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群。它们对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血。

　    常用的分离MSC的方法主要有全骨髓法和密度梯度离心法，(SD大鼠骨髓间充质干细胞)全骨髓法即根据干细胞在低血清培养基中有贴壁优势特性，定期换液除去不贴壁细胞，从而达到纯化及扩增MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中各细胞成分比重的不同，分离单核细胞进行贴壁培养。二者本质上无多大区别。随着对MSC表面抗原认识的深入，又有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化。但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题，加之成本较高和技术的难度，在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

常见分离方法

密度梯度离心法与流失细胞仪分离法价格昂贵且操作复杂、容易导致细胞大量流失，应用相对较少。贴壁培养法应用最早，具有操作简单，对细胞干扰少，不易发生污染等特点较为广泛应用，其缺点是细胞纯度较低，但有关研究表明，BMSCs细胞扩增到P1、P2代后细胞的纯度分别可达到95%、98%。

大鼠骨髓间充质干细胞细胞传代能力测试

细胞形态图：

细胞处于快速分裂的状态，良好的MSCs显示较小的纺锤状的形态，伴有较多的折光的双联体，为新的正在分裂的细胞。细胞首代状态较好，多数呈长梭形生长，部分不规则，极性良好，经传代 5次后，细胞仍较有活力。以1:2 的分种率传代，约48h可长满。

分化测试

1. 成脂诱导分化

细胞汇合度约达 80%时，加入间质干细胞成脂诱导液后，细胞回缩较明显。11 天后已有大量脂滴出现，培养21天后进行油红O 染色，可见被染为红色的较标准的脂滴。

油红O染色试剂盒描述：

     油红O是一种脂溶性重氮染料，用于染色细胞和组织中的脂质和脂肪沉积物。虽然样品可能是新鲜的，冷冻的或福尔马林固定的，但油红O与石蜡包埋的组织切片不相容。观察油红O沉淀是正常的。因此，必须使用Whatman纸或注射器驱动的过滤器单元通过过滤新鲜制备工作溶液。

2.成骨诱导分化

细胞汇合度约达 70%时，加入间质干细胞成骨诱导液，诱导 21 天可见钙结质，进行茜素红染色鉴定， 茜素红与类骨质结合，形成同心圆状的深红色小结节。

茜素红S染色试剂盒描述：

茜素红S （Alizarin Red S,简称ARS ）作为一种染料型配位剂在分光光度分析方面已有了广泛的应用。近年来，很多作者把 ARS 及其金属配位物在汞电极上的吸附催化波用于电分析中，提高了测定的灵敏度和选择性。

3.成软骨细胞分化

细胞汇合度约达 70%时，加入间质干细胞成骨诱导液诱导 21 d 后，使用甲苯胺蓝染色可见较广泛的细胞外基质蓝紫色，尤其在细胞堆积区，图中为细胞密度稍低的区域也可见明显的异染颗粒。

阿利新蓝染色试剂盒描述：

  阿尔辛蓝是一种用于检测细胞软骨形成的染料，它可以染色软骨组织中的硫酸化蛋白多糖。阿尔辛蓝染色试剂盒含有1%的阿尔辛蓝溶液，0.1%的核固红，方便，即用型溶液。在pH 2.5时，阿尔辛蓝染色酸性粘多糖并显示蓝色，而核固红染色核粉红色至红色，细胞质淡粉红色。

表面分子流式检测

CD29:来源  THermoFisher      PE

CD90:来源  THermoFisher      PE

CD45:来源  THermoFisher     FITC

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