氨基酸代谢标记实验

材料与仪器

37℃ 细胞悬液 [35S]标记L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]标记蛋白质水解产物
PBS(冷冻) 37℃ 脉冲标记培养基
配有液体同位素垃圾阀门的真空吸气器

步骤

1. 室温融化 [35S] 标记甲硫氨酸，并用预热的（37℃）脉冲标记培养基制备 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。

2. 室温下 300 g 离心 5 min，获得悬液中 0.5 × 107~2 × 107 细胞。用 10 ml 预热的脉冲标记培养基洗细胞。室温下 300 g 离心 5 min, 吸弃上清。轻柔敲打试管底部使细胞重悬并再洗一次。

3. 用预热脉冲标记的培养基重悬细胞，使其浓度为 5 × 106/ml。在 37℃ 水浴中温育 15 min 以去掉细胞内的甲硫氨酸。定时颠倒试管来使细胞重悬。

4. 室温下 300 g 离心 5 min，吸弃上清。用 2 ml [35S] 标记甲硫氨酸的工作溶液（见步骤 1）重悬细胞，转移至干净 15 ml 离心管中。盖紧盖子。在 37℃ 水浴中温育 10~30 min, 不时轻柔颠倒试管或振荡使细胞重悬。

5. 4℃、300 g 离心 5 min，吸弃上清。用 10 ml 冰预冷的 PBS 轻柔重悬并再次离心。

6. 可选：通过三氯乙（yi）酸（TCA）沉淀来测定标记物的掺入量（见辅助方案）。

7. 如果细胞沉淀不马上使用的话，可以置于冰上几小时或 80℃ 保存几天。分析前冰上融化细胞沉淀。

注意事项

1. 在标记过程中，挥发性的含有[35S]标记的化合物可能会释放，含有[35S]标记甲硫氨 酸的培养基应保存在密闭紧盖的试管中，用前置于37°C水浴。在37°C不能超过60 min。

2. 在大多数情况下，冷冻细胞不会影响蛋白质的生物化学特性，但是在用去污剂溶解后再冻融细胞 抽提物可引起多亚单位复合物的解离或标记蛋白质降解。

常见问题

1. 实验材料中的细胞悬液可以选择如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 细胞杂交瘤等，要求是生长于潮湿、37℃、5% 032温箱中或从组织中制备（如淋巴细胞）。

2. 脉冲标记不会使培养基中的标记物*丧失，因此标记混合物可以重复使用。收集标记的培养 基，小心地用0.45 μm的滤器滤过。细胞标记前后通过闪烁记数标记混合物来估计未掺人放射活 性的百分比。-20°C冷冻条件下标记的混合物可以保存2个月。