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T、B淋巴细胞分离
发布时间： 2022-03-11 点击次数： 1031次原理
淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固稳定而巨大的E-花环，较正常未处理的SRBC形成的E-花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AET-E花环易沉于管底，而未形成E-花环的T淋巴细胞，用低渗液解花环周围的 AET-SRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。
材料与仪器
新鲜豚鼠血
Hanks液 小牛血清 199培养液 生理盐水 氯化钠溶液
离心管 离心机步骤
1. AET-RRBC制备
（1）AET溶液的制备称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143 M 溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。
（2） AET处理RRBC取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AET—RRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分混匀置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（1~2厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤3-5次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AET-RRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AET-RRBC悬液，置4℃保存，不得超过5天。
（3）1%AET-RRBC的配制：将预先配制并保存于4℃冰箱的10%浓度的AET-RRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。
2. 从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。
3. AET—E花环试验：将分离的单个核细胞（2x106/毫升）与等量1%AET-RRBC混合，置37℃水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次，分装数管，每管2—3毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4℃冰箱45分钟。
4. T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离将形成E-花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E-花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E-花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。注意事项
1. 分离B细胞过程较长，为了避免B细胞自然死亡，在最后冲洗B细胞时可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。
2. 每次洗涤时，不要将试管底部液体吸干，即防止压积的B细胞接触空气。
3. 使用抗B淋巴细胞血清与受检细胞按NIH方法进行微量B细胞毒试验，使用倒置相差显微镜读数。
常见问题
关于从小鼠脾脏中分离：
1.脾脏组织所含结缔组织比较少，可以直接在筛网上研磨，无需剪碎，也不用顾虑血管。
2.ficoll中含多聚糖，所以许多人喜欢把它放4度存放，是否室温对实验影响不大脾脏分离淋巴细胞实验比较简单，所以用普通的淋巴细胞分离液就行。
3 .离心2000rpm×20min，这步很关键，还有就是加细胞悬液时一定要贴壁缓慢加入，不要破坏分界面，分离液与细胞悬液我常用1：2，还有就是所选用的离心管粗细也会影响分层。
4.中间的悬浮白色环状细胞层即是所要的淋巴细胞层。
5.洗细胞主要是洗去分离液，所以不能省去。
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