补骨脂素介导的光交联反应研究RNA与蛋白质分子间的作用实验

步骤

一、材料与设备

1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

2. 光化学反应装置（360 nm 长波长）：建议采用 Rayons RPR-100 光化学反应装置 ( The Southern New England Ultraviolet Company，Branford，USA )。其他紫外光源 ( 如 Stratalinker ) 也都可以使用。此外，长波长的手提紫外灯（如 Model UVGL-25， San Gabriel，CA，USA ) 也适用于交联反应，但需要照射较长吋间。

3. Sep-pak C18 胶片，购自 Waters ( MiIford，MA，USA）公司。

4. 旋转真空干燥仪。

5. Sigmacote ( 可购自 Sigma 公司，St. Louis，MO，USA；为 Sigma 公司的一种硅烷化试剂）。

6. 变性胶电泳缓冲液（TBE）：0.09% mol/L Tris-硼酸，0.002 mol/L EDTA。配制 5X TBE 储存液：取 900 ml 双蒸水溶解 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸，加入 20 ml 的 0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0 ) 定容 1L， 高压灭菌后保存。

7. 非变性胶电泳缓冲液：含 0.1% Triton X-100 的 TBE 缓冲液。

8. 1X 结合缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100。

9. 10X 水解缓冲液：等体积混合 0.5 mol/L Na2CO3 和 0.5 mol/L NaHCO3 ( pH 9.2 )。

10. Nase T1，RNase T1 缓冲液：16 mmol/L 柠檬酸钠（pH 5.0 )，0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/mL tRNA，3.5 mol/L 尿素。

11. Nase B cereos，Nase B cereos 缓冲液：16 mmol/L 柠檬酸钠（pH 5.0 )， 0.8 mmol/L EDTA，0.5 mg/ml tRNA。

12. 电泳上样缓冲液：9 mol/L 尿素，1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚蓝或 98% 甲酰胺。1 mmol/L EDTA，0.1% 溴酚蓝；非变性电泳上样缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)，20 mmol/L KCl，0.1% Triton X-100，40% ( m/V ) 甘油，0.1% 溴酚蓝。

13. 40% (m/V) 丙烯酰胺储存液：380 g 丙烯酰胺，20 g 甲叉双丙烯酰胺，定容至 1 L，过滤后 4°C 保存。变性胶工作液中含 7 mol/L 尿素和 1X TBE；非变性胶工作液中含 0.1% Triton X-100 和 1X TBE。

14. RNA 洗脱缓冲液：TBE 缓冲液 ( pH 7.2 ) ( 以 0.1 mol/L HCl 调 pH )。

15. 四甲基乙二胺（TEMED) 和过硫酸铵。

16. 补骨脂素修饰的多肽或蛋白分子，5' 或 3' 末端标记 32P 的 RNA。

17. AMV 反转录酶及反应缓冲液（购自 Promega 公司）。

18. 放射自显影所需的 X 射线片，压片盒及图像处理仪器等。

19. 蛋白酶 K 及反应缓冲液：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.8 )，5 mmol/L EDTA 和 0.5% SDS。

20. 8-羟基补骨脂素，1，3-二碘丙烷，碳酸钾，丙酮，石油醚，乙酸乙酯，硫酸钠，硅胶 ( 购自 Aldrich 公司 )。

21. 0.1 mol/L 磷酸钠（pH 7.4 )。

22. 10% 三Fyi suan水溶液。

23. 二甲基甲酰胺。

二、操作方法

1. 同半胱氨酸反应的补骨脂素合成

即合成 1 号化合物：8-[ ( 3碘丙基-1 )氧 ]补骨脂素 [ 8-[ ( 3-iodopropyl-1) oxy] psor-alen ]。

(1) 在 100 ml 的脚底烧瓶内将 8-羟基补骨脂素（0.176 g，1 mmol )，1，3 -二碘丙烷 ( 1.15 ml，2.96 g，10 mmol ) 和碳酸钾（1.38 g，10 mmol ) 溶解于 15 ml 丙酮中。

(2) 混合物于室温振摇 10 h，薄保层析法对反应进行检测（展开剂：石油醚：乙酸乙酯，4：1 )。反应*时无起始物质。

(3) 真空浓缩燥反应物。

(4) 30 ml 水溶解干燥产物，以 20 ml 乙酸乙酯萃取 3 次。

(5) 用 30 ml 水洗萃取产物，再用 10 ml 饱和氯化钠洗 1 次萃取产物。

(6) 加入约 2 g 硫酸钠，室温放置 4~6 h。

(7) 以硅胶对反应产物进行层析，石油醚：乙酸乙酯（4 : 1 ) 洗脱产物。纯化得到的 1 号化合物（0.31 g ，产率为 85% ) 为淡黄色固体。

2. 补骨脂素与蛋白结合

(1) 通过定点突变或固相合成多肽将活性半胱氨酸插入到蛋白的特定位置。

(2) 对蛋白进行纯化和特性检测之后将蛋白 (1 nmol ) 和前面制备的 1 号化合物 (10 nmol ) 一同溶解于 100 μl 二甲基甲酰胺。

(3) 加入 50 μl 0.1 mol/L，pH 7.4 的磷酸钠缓冲液，调 pH 至 7.0。

(4) 室温放置 16 h。

(5) 在反应液中加入约 10 μl 10% 三Fyi suan水溶液调节溶液的 pH 至 4.0~5.0 之间。

(6) 用 0.5 ml 氯仿提取未反应的补骨脂素，重复 3 次。

(7) 用 0.2 ml 1% 三Fyi suan水溶液洗有机相 3 次，回收溶解的多肽。

(8) 合并水相，在旋转真空浓缩仪中将总体积浓缩至约 200 μl。

(9) 通过 TIPLC ( 采用 Zorbax 300 SB-C8 column 或其他适用于所研究的蛋白的柱料）纯化结合补骨脂素的蛋白。所得到的结合了补骨脂素的蛋白的产率通常为 80% 左右。

3. 光交联

(1) 小量交联反应

在进行交联反应前先制备变性聚丙烯酰胺凝胶（含 1X TBE 和 7 mol/L 尿素）。

将制备好的凝胶以 30W 功率预电泳 3~4 h。

将末端标记了 32P 的 RNA 溶解于 20 μl 结合缓冲液中（终浓度约为 2.5 μmol/L )， 85℃ 加热 3 min 使 RNA 变性，再让其逐渐冷却至室温，使 RNA 再折叠。

取 2 μl RNA，2 μl 5X 结合缓冲液，1 μl 0.1 μg/μl 酵母 tRNA，1~5 μl 双蒸水，再加入结合了补骨脂素的蛋白，终体积为 10 μl ( 加入的蛋白量可通过凝胶电泳分析，选取合适的 RNA/蛋白比率)。

将反应液混匀，冰浴 20 min；同时用 95% 乙醇擦洗一个干净的小玻璃平板，用 Sigmacote 硅化，从而更好的回收交联后的样品，将平板罝于冰上。

将准备好的样品转移到平板上，紫外照射（360 nm）10 min 至 20 min ( 最佳照射时间需根据时间-效成曲线判定）。

将照射后的样品转移至一个新的小管内，以 10 μl 上样缓冲液冲洗平板上残留的样品斑点后也合并入小管内。

再向经照射的样品中加入 10 μl 上样缓冲液，再在所有的样品中加入 1 μl 20 μg/μl 酵母 tRNA 竞争 RNA 蛋白的结合。

所有的样品于 90°C 加热 3 min，上样电泳，以 30W 功率电泳 2~4 h，直至溴酚蓝前沿距胶底部 5 cm 位置。

拆胶后用保鲜膜包裹，于 -80℃ 放射自显影。

(2) 大量交联的制备

确定 RNA 分子上的交联位点时需要大量的交联反应。前面提及的交联反应可以扩大 100 倍甚至更大，而终体积却可以缩小至原先的一半。在紫外照射交联时，为保证交联效率和便于操怍，点在平板上的样品最好不要多于 20 μl。

电泳胶的制备同前所述，同样需要预电泳。

在紫外照射后，用 1/10 体积 3 mol/L NaAc ( pH 5.2 ) 和 2.5 倍体积的无水乙醇于 -80℃ 放置 30 min 以沉淀 RNA 和 RNA 交联物。

于 16000 g 离心 20 min 去上淸，用少量的 75% 乙醇洗沉淀，再次离心去上淸。真空抽干。

用上样缓冲液重悬产物，加入酵母 tRNA，90℃ 加热 3 min，上样电泳，同时在旁边上样孔内加入末端标记的 RNA 作为对照。

拆胶后用保鲜膜包裹，于室温放射自显影（时间较短）。

对照放射自显影的结果切下 RNA 和交联物，捣碎，用 RNA 洗脱缓冲液洗脱，乙醇沉淀冋收。

4. 确定交联位点

可以通过对纯化的 RNA 交联物进行 RNase 不*消化和碱水解反应来确定 RNA 上的交联位点。片段的大小可以通过与已知序列和长度的寡核苷酸（经 RNasc T1 和 RNase B. cereus 消化的 RNA ) 进行比较来确定。

对于大量的或结构不稳足的且不适于碱水解的 RNA，可以通过对纯化的 RNA 交联物进行引物延伸分析来找到 RNA 上的精确的参与交联的位点。以 RNA 为模板反转录合成的 cDNA 拷贝终止于 RNA 的修饰位点或交联位点，通过与对照序列的比较就可以找到反转录的终止位点。

(1) 不*碱性水解反应确定 RNA 交联位点

将 32P 标记的 RNA 分別加入两个干净的离心管内，标号 No.one，No.2； 将 RNA-蛋白交联物加入第三个离心管，标号 No.3。

在 No.noe 管中加入 1 μl 10X RNase 缓冲液，1 μl 0.1 U/μl 的 RNase T1 或 RNase B. cereus，加双蒸水至 10 μl，55℃ 孵育 6~12 min 。此反应是水解反应的片段大小对照。

另两管加入 1 μl 10X 水解缓冲液，再加双蒸水至10 μl，85℃ 孵育 8 min 得到 RNA 的碱水解片段。

三管均加入了上样缓冲液，置于冰上，于 95℃ 加热 2 min，上样，变性胶电泳（胶已经以 30W 预电泳 4 h ) 至所有条带得到充分分离。

放射自显影。

(2) 反转录（引物延伸分析）法确定 RNA 交联位点

此方法中通常的 RNA 或 RNA 蛋白交联物的用量为 0.1~1 pmol （具体用量取决于 32P 标记的 DNA 引物的活性）。

用蛋白酶 K 消化 RNA-蛋白交联物，生成的 RNA-蛋白交联物中的多肽仅含存较少的氨基酸：用 50 μl 蛋白酶 K 反应缓冲液重悬从胶中纯化得到的 RNA-蛋白交联物，加入 1 μl 蛋白酶 K 储存液（2.5 mg/ml )，于 37℃ 反应 30 min。

乙醇沉淀 RNA-蛋白交联物（方法同前），变性胶电泳纯化 RNA 产物（方法同前）。

在反应管中加入 4 pmol 未交联的 RNA，4 pmol 32P 标记的 DNA 引物，2 μl 5X 反转录缓冲液，双蒸水补充体积至 10 μl。另一反应管内加入消化后的 RNA-蛋白交联物，1 pmol 32P 标记的 DNA 引物，0.5 μl 5X 反转录缓冲液，双蒸水补充体积至 2.5 μl。75°C 退火 3 min，渐冷却至室温，离心收集产物。

分别以 G、A、C、U 和 X 标记五个反应管，均加 3 μl 核苷酸混合物，1 μl 5X 反转录缓冲液，在 G、A、C、U 各管中加入 2.5 μl 步骤(3)中未交联的 RNA 混合液，将步骤(3)中 RNA-蛋白交联物的混合液加入反应管 X。

在每个反应管中加入 1 μl ( 5 U/μl ) AMV反转录酶，起始延伸反应。

室温温育 10 min，于 42℃ 温育 50 min。

向每个反应管中加入 12 μl 上样缓冲液终止反应，95℃ 加热 5 min，进行变性胶电泳。

放射自显影。