科研小白入门必修之MTT实验操作总结

1.接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积180ul-200ul.

2.培养细胞：同一般培养条件，正常培养2-3天也可根据试验目的和要求决定培养时间。

3.显色：每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4.比色：选择480nm-570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增殖率等。

1.细胞消化。若消化出现问题，则会影响细胞的活性，进而影响 OD 值。对于 MCF-7、BT474等一系列容易消化的细胞，消化时胰蛋白酶中不添加 EDTA，只需胰酶浸润数秒即可。然而，对于caco-2等一系列难以消化的细胞，胰蛋白酶中可添加浓度为 0.25% 的 EDTA。

2.选择适当得细胞接种浓度。

3. 结晶物的溶解。加入 DMSO 溶解后，将加入DMSO的96孔板放入37℃ 孵箱内孵育 10～20 min，这样有助于 DMSO对紫色结晶物的溶解（尤其在冬天）。

4..避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在显色后尽量吸尽孔内残余培养液，弃去培养液时，吸取的时候要注意移液头要紧贴孔内侧壁吸取，不要触碰底部的紫色结晶；或者将96孔板倒扣于滤纸上来吸取孔内的培养液。

5.设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。每组设定3复孔。

6.MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

7.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。

8.选择不同的波长，酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的选择相应的波长。