原代细胞培养

原理

鼠胚原代培养是原代培养一个类型，是指从孕鼠中剖取适宜胎龄的胎鼠，从特定组织中分离出细胞，在适宜条件下增殖培养，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。

用途

1、药物筛选实验；
2、信号通路与机制研究；
3、生物制品的生产(如制备单克隆抗体）等 

材料与仪器

【仪器设备】超净工作台、滤器、CO2 培养箱、电热干燥箱

【器械及器皿】培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪

【试剂】:常用培养基还有：DMEM-高糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可根据培养需求合理选择。

血清:一般常用为胎牛血清，人血清和其它动物血清。

平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体,维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank's 等。

抗生素:常用为青霉素和链霉素。

其它添加成分:缓冲系统，常用为HEPES，在 20 度时为 7.55；37 度为7.31; HEPES 不是起维持 PH 恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速 PH 变化的，所以调整 PH 常常用 NaHCO3 溶液。

有机补充物,如丙酮酸钠，谷氨酰胺等。促细胞分裂因子，如生长因子类的 FGF、EDF。贴璧和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。

怀孕的母鼠、多聚赖氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液

步骤

1、胚鼠原代培养：

1.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 分钟；

1.2 取材:取怀孕母鼠，颈椎脱臼法处死后，整个鼠体浸入盛有纯酒精的烧杯中浸泡 1 分钟。取出母鼠在不锈钢手术盘中用无菌手术剪打开腹腔，取出鼠胚，放入无菌培养皿内。注意取材可在无菌操作台外操作。

1.3 用 70-75% 酒精擦拭装有鼠胚的培养皿外周后，将培养皿移至超净工作台或生物安全柜中，用含双抗 Hanks 液洗涤鼠胚数遍却除血污。在体视显微镜下进行操作，用无菌手术器械去除多余组织，用解剖镊剖取需要的组织，移入含解离液或培养基的 50 ml 离心管中，用眼科剪将组织剪碎成1立方毫米的肉糜状；

1.4 在含组织的 50 ml 离心管中加入解离液或培养基至 10 ml。首先用 10 ml弯头滴管对组织进行吹打 5-10 次，然后用 1 ml 枪头的吹打组织，最后用 200 μl 的尖的一端进行吹打；

1.5 将上述组织悬液通过 70 μm 过滤器过滤切碎和分散的组织悬浮液，然后 l200 rpm， 4℃ 离 10 分钟；

1.6 弃掉上清，加入配置好的细胞培养基重悬细胞，接种于经多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板中，将其置于于 37℃、5% CO2 培养箱中，三天后换液，以后每两天换细胞培养液；

2、传代培养

2.1 实验前，超净工作台或生物安全柜紫外灯提前照射 30 min，开始实验时，酒精擦拭消毒双手；

2.2 将原代培养的培养瓶倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代培养；

2.3 用酒精棉球擦净操作台，点燃酒精灯，将培养瓶口灼烧消毒；

2.4 倒掉培养瓶中的旧培养基，留下贴壁生长的细胞；

2.5 在培养瓶中加入适量 0.25 % 胰酶至刚好漫过贴壁生长的细胞即可，拧上瓶盖，将培养瓶置于37℃的培养箱中 5 min。在此期间，如果在显微镜下观察可以看到细胞收回突起变成圆形。

2.6 取出培养瓶,轻轻摇晃培养瓶或吹打使细胞脱离瓶壁，将细胞悬液移至离心管中，4℃、800 rpm离心 5 min；

2.7 弃掉离心管中的上清，加入细胞培养基重悬细胞植于多聚赖氨酸预处理的培养瓶或培养板，再将其置于37℃、5% CO2培养箱中培养，此时细胞可以继续分裂而传代。

注意事项

1、原代培养注意事项：

1）原代培养要重点注意无菌操作，所用器械需提前高压灭菌；

2）因为鼠胚原代培养时，获取组织较少，建议在冷光源体视显微镜下操作；

3）原代细胞培养过程比较慢,培养时间最少需要一周以上的时间。若 2 天后可能会出现培养基变黄的现象,且无漂浮物,排除污染，属于正常现象,这是因为细胞在贴壁生长过程中释放了CO2 和其他物质导致培养液 PH 发生了改变,所以变黄；

4）正常贴壁细胞在培养几天后,会逐渐贴满整个瓶底或者皿底,呈现出相应的形状,有的呈纤维状,有的星多边形；

5）细胞的第一次传代,一定要密度高一些传代原代细胞传代密度低,很难长起来。建议 1:2-13传代如果细胞数量够的条件下,P2-P3 代完成实验是最合适的。如果细胞数量不够,那细胞的提取和培养比较重要,尽可能地让细胞的好状态多维持几代对实验成败来说至关重要；

6）原代细胞不建议冻存,因为冻存很容易复活不成功。如果要冻存的话,建议在 P2或P3 代冻存,一些比较难复苏的细胞可以适当提高冻存液中的血清浓度；

7）很多原代细胞的体外培养需要加入生长因子,细胞才能正常的生长增殖和分化；

2、细胞传代注意事项：

1）细胞离心时离心速度建议800-1000 rpm/min，4℃ 离心 5 分钟，避免转数过高，造成细胞破碎死亡；

2）消化时，注意观察，切勿消化过度；

常见问题

1、当在显微镜下观察细胞形态时发现，多数细胞已经失去分裂能力了，而好的细胞应该呈现长梭形，立体感强。因此，这些细胞不能用于传代细胞的培养。

2、理论上，在显微镜下可以观察到梭形的细胞说明传代培养成功。和原代培养的观察类似。但是总的来说，我们实验室的实验结果不是很好，观察到的好的细胞很少。其原因可能和原代培养时候的相近。

3.对于不能进行传代培养的细胞我们进行了活性的观察实验。

用台盼蓝染液染色，取 9 滴细胞液加 1 滴台盼蓝，染色不超过 3 分钟，在显微镜下观察可以发现，有的细胞核被染成蓝色，而有的细胞核没有着色。

这是因为细胞核被染色的细胞是死细胞，而未被染色的则是活细胞,通过这个实验可以计算视野中细胞的存活率。

4、细胞增殖分化缓慢：有些原代细胞体外培养需要加入生长因子，细胞才可正常增殖和分化，因而，实验前要根据具体细胞配置相应培养基；

5、细胞污染：细胞污染类型分为：物理污染、化学污染以及生物污染，因而原代培养要严格无菌操作，培养基专用专配不要交叉使用；

6、消化时，细胞长时间难以消化下来：胰酶使用前，需要在 37℃ 水浴锅充分预热，已达到最佳酶活性；