细胞增殖分析（CCK-8 法）

原理

CCK-8 是 MTT 的升级产品，其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。

生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，与细胞毒性成反比，间接反映活细胞数量。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

用途

用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、药物筛选、抗肿瘤药物敏感性测定。

材料与仪器

【材料】细胞悬液

【试剂】 CCK8

【仪器，耗材】96 孔板，二氧化碳培养箱，酶标仪

步骤

1、取对数生长期的细胞制备细胞悬液，细胞计数；

2、根据合适的铺板细胞数接种到 96 孔板中，每孔约 200 ul（2×103-2×104/孔）细胞悬液，同样的样本可做 3-5 个重复，将 96 孔板在 37℃、5%CO2 培养箱中培养 24,48,72 h；

3、设置空白对照组：不加细胞只加培养液的空白对照，其他试验步骤保持一致。细胞接种后贴壁大约需要培养4-8小时；

4、加入20ul CCK8：由于每孔加入CCK8 量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含 10% CCK8 的培养基，以换液的形式加入；

5、培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）；

6、测定 450 nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长 450-490 nm，参比波长600-650 nm。

注意事项

1、当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。避免边缘效应。     

2、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板。

3、细胞种板数不易过多，否则细胞自身发生接触抑制，影响OD数值，较长培养时间建议每孔加入200 μl培养基。                                    

4.若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24 小时内测定，吸光度不会发生变化。                 

5、悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

6、加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或 pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

常见问题

Q：96 孔板最边缘的细胞吸光值都较大？

A：这是边缘效应导致的，长时间培养过程中，一般边缘的孔中培养基挥发较多，培养基中各成分相对浓缩，细胞生长会更快，不能正确反映真实的细胞生长速度，所以需要弃用周围一圈孔板，加入培养基或 PBS。