原代角质形成细胞的分离培养方法

原代细胞在相关细胞实验使用过程中越来越多，人们不再单单趋于使用细胞系进行实验研究，因为细胞系常常由于体外长期培养，而容易丢失原有的生物学特性，对药物处理的反应差距越来越大。

原代细胞刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也*为接近和反应体内生长特性，原代细胞的活力和生长状态都比较好，细胞的纯度和基因保留可达到90%以上，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等试验研究，使用原代细胞进行实验，可以获得更准确的研究和数据。

角质形成细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。

角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。细胞组织来源于实验动物的正常皮肤组织，细胞生长状态为贴壁培养。

1.培养基1：iCell原代角质细胞培养体系

4.基础培养基：DMEM/F12

5.缓冲液：无菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH=7.4

6.消化液1：1.2U/ml的dispase Ⅱ

7.消化液2：0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA

8.消化液3：0.1%Ⅰ型胶原酶

9.75%医用酒精

10.胎牛血清（FBS）

1.培养皿

2.T-25细胞培养瓶

3.100目不锈钢网筛

4.200目不锈钢网筛

5.眼科剪

6.眼科镊

7.离心管（15ml、50ml）

1.新鲜的包皮组织，装盛于含有无菌生理盐水或1×PBS的无菌容器中，于保温盒中，冰上放置离体6h内运输到实验室进行后续分离。

2.在无菌环境中取出包皮组织，用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后，75%的酒精浸泡100s

3.酒精浸泡组织后快速将组织转入装有1×PBS的培养皿中震荡清洗数次以去除酒精，然后用眼科剪小心剪去皮下组织（脂肪，微血管等）

4.将去除了脂肪和微血管组织的再用1×PBS清洗几次后，剪成3mm*8mm左右的皮片，用消化液1  4度消化过夜（15-18h）。

5.第二天，用2个眼科镊子小心撕开过夜消化的皮肤组织，分离真皮和表皮；

6.分离的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。

7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右，然后用含血清的培养基终止消化，过200目不锈钢网筛后取滤悬液，转入15ml离心管中，400g离心10分钟，离心完成后弃去上清，沉淀用3ml的1×PBS吹打重悬后，400g离心5min离心完成后弃去上清，沉淀用2ml的原代角质细胞培养基吹打重悬后，转入已经装有2ml培养基的T-25培养瓶中，将培养瓶置于37℃的二氧化碳培养箱中培养。

8.视细胞贴壁情况48-72h后换液去除未贴壁的细胞，之后继续培养，视细胞生长状况和培养基颜色每2-3d换液一次；待细胞贴壁率达到80-90%后，进行常规传代扩增操作（角质细胞对胰酶不太敏感，消化时间可能会增加到10-15分钟，有时需要配合使用无菌细胞刮铲进行传代）。