测定蛋白含量都有哪些方法？

蛋白的含量的测定方法主要有紫外分光光度法、Lowry法、BCA法等。

紫外分光光度法

原理

蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环在275~280mm有一紫外吸收峰。在一定浓度范围内，其在280mm的吸光度与蛋白浓度成正比。

方法

取适量蛋白溶液（约3.5ml），置于光径为1cm的石英比色杯、用与溶解蛋白的缓冲液相同的缓冲液为对照，在280mm波长处测定吸光度，吸光度为1.0的蛋白溶液，蛋白浓度约为1.0mg/ml。当溶液中含少量核酸时，应同时测定260nm波长处的吸光度，以下式估算蛋白浓度：蛋白浓度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260。该测定方法误差较大，有紫外光吸收的物质（如核酸）干扰大。

材料和仪器

（1）4%Na₂CO3；（2）0.2mol/LNaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钠。试剂A：使用前，将(1)(2)(3)(4)试剂以50：50：1：1的比例混合均匀，当天使用。试剂B：酚试剂。

Lorry法

Lowry法灵敏度较高，线性范围为20~100ug/ml。该方法干扰因素主要有：高浓度的胍盐、尿素等变性剂，Triton、Tween等去垢剂，EIDTA等整合剂，以及Tris、甘氨酸等等。

材料和仪器

材料：（1）4%Na₂CO3；（2）0.2mol/LNaOH；（3）1%CuSO4；（4）2%酒石酸钠。试剂A：使用前，将(1)(2)(3)(4)试剂以50：50：1：1的比例混合均匀，当天使用。试剂B：酚试剂。

仪器：分光光度计。

操作步骤

（1）准确称取10mg标准蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸馏水溶解定容至100ml。

（2）取6支试管分别编为0~5号，分别加入步骤（1）制备的标准蛋白溶液0、0.08、0.16、0.24、0.32、0.40ml，并都用蒸馏水补足至0.4ml。

（3）各试管加入试剂A 2ml，混匀，室温放置10分钟。

（4）各试管加入试剂B 0.2ml，立即混匀，室温或37℃水浴中，保温30分钟。

（5）在分光光度计上，以0号为参比，测定各管样品在750mm的吸光度值。

（6）以蛋白浓度为横座标，吸光度为纵座标绘制标准曲线，或作直线回归。

（7）取样品溶液0.4ml，按步骤（1）~（5）测定，将测得的吸光度值代入上述标准曲线，计算蛋白浓度。

注意：如果样品浓度过高，可用蒸馏水作适当稀释。

BCA法

BCA法的优点是抗干扰能力强，其原理是：在碱性溶液中，蛋白将二价铜还原成一价铜，后者与试剂中的BCA（二辛可酸，Bicinchoninic acid）形成一个在562mm处具有最大吸光度的紫色复合物，其吸光度与蛋白浓度成正比，线性范围20~100ug/ml。

材料和仪器

试剂A：1%BCA二钠盐，2%碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4%氢氧化钠和0.95%碳酸氢钠。用50%NaOH或碳酸氢钠调pH11.25。

试剂B：4%硫酸铜

工作液：100倍体积试剂A与2倍体积试剂B混合。

操作步骤

（1）准确称取10mg标准蛋白（常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白）加蒸馏水溶解定容至100ml。

（2）取6支试管分别编为0~5号，分别加入步骤1制备的标准蛋白溶液0、20、40、60、80、100 ul，并都用蒸馏水补足至100ul。

（3）各试管加入工作液2ml，混匀，37℃水浴保温30分钟。

（4）在分光光度计上，以0号为参比，测定各管样品在562mm的吸光度值。

（5）以蛋白浓度为横座标，吸光度为纵座标绘制标准曲线，或作直线回归：

（6）取样品溶液100 ul，按步骤1~4测定，将测得的吸光度值代入上述标准曲线，计算蛋白浓度。

注意：如果样品浓度过高，可用蒸馏水作适当稀释。

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